Dieses Protokoll ist wichtig, weil es die Quantifizierung von zwei Proteinen in derselben Hirnregion ermöglicht. Dies ermöglicht es dem Experimentator, die Aktivität in molekularen Signalwegen in Hirnregionen zu betrachten, indem er Pan- und Phosphoproteine ansieht. Es kann auch verwendet werden, um Proteine zu assay, die Marker für verschiedene kognitive Phänomene sind.
Wir verwenden eine relativ einfache Technik, wie die Immunhistochemie, um Fragen zu beantworten, die in der Regel mehr beteiligte Techniken erfordern. Einschließlich der Untersuchung der Aktivität molekularer Signalwege, Untersuchung des AMPA/NMDA-Verhältnisses. Mit einem Kryostat zwischen minus 9 Grad Celsius und minus 12 Grad Celsius, Schneiden Sie zuvor isoliert und gefrorene Ratten Gehirn in Regionen von Interesse bei 30-50 Mikrometer.
Scheiben direkt auf Glasrutschen montieren und bei minus 80 Grad Celsius bis zur Immunzytochemie lagern. Entfernen Sie die Glasgletten aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausdemieren. Arbeiten unter einer Dunstabzugshaube, legen Sie die Dias in 4%Paraformaldehyd in 0,1 molaren PBS für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur für Gewebefixierung.
Dann spülen Sie die Dias in 0,1 Molaren TBS dreimal für jeweils 10 Minuten. Um Zellmembranen zu permeabilisieren, inkubieren Sie die Dias 30-60 Minuten lang in einem milden Reinigungsmittel. Und spülen Sie wieder in TBS dreimal für jeweils 15 Minuten.
Verdünnung des primärantikörpers für Protein von Interesse an PBS in der richtigen Konzentration, wie im Manuskript beschrieben. Pipette primäre Antikörperlösung direkt auf das Gehirngewebe. Legen Sie Deckelrutschen auf die Dias und inkubieren Sie das Gehirngewebe in primäre Antikörperverdünnung für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation entfernen Sie die Deckelscheine und waschen Sie die Dias in TBS, dem eine kleine Menge Reinigungsmittel zugesetzt wird, viermal für jeweils 15 Minuten. Sekundärantikörper in einem Verdünnungsmittel, das TBS, Waschmittel und 1,5 % des Wirtsserums enthält, verdünnen. Sekundären Antikörper zu den Dias hinzufügen, mit Deckelscheine abdecken und bei Raumtemperatur zwei Stunden lang inkubieren.
Nach der Inkubation spülen Sie die Dias in TBS-T viermal für jeweils 20 Minuten und dann viermal für jeweils 20 Minuten in TBS. Trocknen Sie die Dias bei Raumtemperatur im Dunkeln, über Nacht. Platzieren Sie Dias auf der Nahinfrarot-Scan-Schnittstelle mit dem Nachuntengewebe.
Bildn ermehrere Folien gleichzeitig mit dem Auswahlwerkzeug. Stellen Sie die Dias mit der höchsten Qualitätseinstellung mit einer Auflösung von 21 Mikrometern ab. Importieren Sie Bilder in einem Offset von null Nanometern in Bildanalysesoftware, um sie für die semiquantitative Proteinanalyse anzuzeigen und zu markieren.
Wählen Sie nach dem Öffnen der Bildanalysesoftware den Arbeitsbereich aus, in den das Bild gescannt wurde. Öffnen Sie dann das gescannte Bild in der Bildanalysesoftware, um die angezeigten Scan- und Längenwellenlängen, Kontraste, Helligkeit und Vergrößerung anzuzeigen, ohne das Rohbild oder die gesamte quantifizierte Emission zu verändern. Nachdem Sie die Schlüsselbereiche für die Quantifizierung identifiziert haben, wählen Sie die Registerkarte Analyse am oberen Rand der Seite aus, und wählen Sie dann Rechteck zeichnen aus, um ein Rechteck über den zu quantifizierenden Bereich zu zeichnen.
Um die Rechteckgröße anzuzeigen, wählen Sie Shapes unten links auf dem Bildschirm aus. Wählen Sie dann Spalten unten rechts aus. Fügen Sie dann Spalten in Höhe und Breite hinzu, um die Formgröße zu identifizieren.
Benennen Sie schließlich die Form, und wiederholen Sie sie. Sobald alle Regionen abgetastet wurden, fahren Sie mit dem Kombinieren und Analysieren der daten aus der Registerkarte Spalten fort. Um zu überprüfen, ob dieses Protokoll funktioniert, wurden Hirnabschnitte mit primären und sekundären Antikörpern, sekundärem Antikörper allein oder weder primärem noch sekundärem Antikörper inkubiert.
Die sofortige frühe frühe Gen-c-jun-Expression wurde im dorsalen Hippocampus und Amygdala nur nachgewiesen, wenn sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper auf das Gehirngewebe angewendet wurden. GluR1-Untereinheit des AMPA-Rezeptors und die NR2A-Untereinheit des NMDA-Rezeptors wurden im Stuhlproteinnachweis in Amygdala-Kernen assayed. Dies ermöglichte die Untersuchung des Verhältnisses der AMPA-NMDA-Rezeptoren in Subkernen der Amygdala, die eine neurobiologische Signatur des Lernens und Gedächtnisses ist.
Mittlere und normalisierte Messungen der Proteinexpression wurden aus hochauflösenden Scans im ventralen Hippocampus gewonnen. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software wird ein Rechteck in den Bereich des Interesses gelegt und die mittlere Intensität des Lichts aus der Form wurde als Maß für die Fluorophorexpression verwendet, die ein Maß für die Proteinexpression ist. Um die normalisierte Kurve zu erhalten, wurde eine Form über einen Bereich gelegt, der ein hohes Signal ausdrückt, und ein niedriges Signal im Bereich unter der Kurve wurde als Maß für die Proteinexpression verwendet.
Der größte Kampf mit diesem Verfahren ist es, einen Antikörper zu finden und sicherzustellen, dass es funktioniert. Die Anwendung ist einfach. Mein Rat wäre, zuerst ein regelmäßiges immunhistochemisches Verfahren zu versuchen, dann versuchen Sie diese Technik.
Führen Sie immer zuerst einen Validierungstest durch. Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist, Ihre Antikörperverdünnung zu überprüfen und sicherzustellen, dass sie richtig angewendet wird. Ohne diese Schritte schlägt das Verfahren fehl.
