Bu protokol önemli çünkü aynı beyin bölgesindeki iki proteinin sayısallaştırılmasına olanak sağlar. Bu deneyci pan ve fosfoproteinler atayarak beyin bölgelerinde moleküler sinyal yolları aktivitesi bakmak için izin verir. Aynı zamanda farklı bilişsel olayların belirteçleri olan proteinleri taramak için kullanılabilir.
Biz genellikle daha ilgili teknikler gerektiren soruları cevaplamak için, immünohistokimya gibi nispeten basit bir teknik kullanıyoruz. Moleküler sinyal yollarının aktivitesinin incelenmesi, AMPA/NMDA oranının incelenmesi de dahil. Eksi 9 santigrat derece ve eksi 12 santigrat derece arasında tutulan bir kriyostat kullanarak, dilim daha önce izole ve 30-50 mikrometre ilgi bölgelerinde dondurulmuş sıçan beyin.
Doğrudan cam slaytlar üzerine dilim monte ve immünostochemistry kadar eksi 80 santigrat derece saklayın. Dondurucudan cam slaytları çıkarın ve 30 dakika oda sıcaklığına dengede bekleyin. Bir duman kaputu altında çalışma, doku fiksasyonu için oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca 0,1 molar PBS% 4 paraformaldehit slaytlar yerleştirin.
Daha sonra slaytları 0,1 molar TBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Hücre zarlarını permeabilize etmek için, 30-60 dakika hafif bir deterjan slaytlar kuluçka. Ve her biri 15 dakika boyunca tbs üç kez tekrar durulayın.
El yazmasında açıklandığı gibi pbs'ye ilgi çeken protein için primer antikorları doğru konsantrasyonda seyreltin. Pipet primer antikor solüsyonu doğrudan beyin dokusuna. Kapak kaymalarını kaydıraklara yerleştirin ve beyin dokusunu oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca primer antikor seyreltmede kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra kapak fişlerini çıkarın ve her biri 15 dakika boyunca dört kez dört kez, içine az miktarda deterjan eklenen TBS'de kaydırakları yıkayın. TBS, deterjan ve %1,5 oranında serum içeren bir seyreltmede sekonder antikor seyreltin. Slaytlara ikincil antikor ekleyin, kapak fişleri ile kaplayın ve iki saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, TBS-T'deki slaytları her biri 20 dakika boyunca dört kez, sonra tbs'de her biri 20 dakika boyunca dört kez durulayın. Slaytları bir gecede karanlıkta oda sıcaklığında kurutun. Aşağı bakan doku ile yakın kızılötesi tarama arayüzü üzerine slaytlar yerleştirin.
Seçim aracını kullanarak aynı anda birden çok slayt görüntüleyin. 21 mikrometre çözünürlüğe sahip en yüksek kalite ayarını kullanarak slaytları görüntüleyin. Sıfır nanometre bir ofset olarak, görüntü analiz yazılımı içine görüntü analiz yazılımı içine görüntü almak görüntülemek ve yarı kanitatif protein analizi için işaretlemek.
Görüntü analizi yazılımını açtıktan sonra, görüntünün tarandığı çalışma alanını seçin. Ardından, görüntüyü görüntülemek ve ham görüntüyü veya toplam sayısallaştırılmış emisyondeğiştirmeden gösterilen dalga boylarını, kontrastı, parlaklığı ve büyütmeyi ayarlamak için görüntü analizi yazılımındaki taranmış görüntüyü açın. Nicelikiçin önemli bölgeleri belirledikten sonra, sayfanın üst kısmındaki analiz sekmesini seçin ve ardından sayısallaştırılacak alanın üzerine dikdörtgen çizmek için dikdörtgen çizin.
Dikdörtgen boyutunu görüntülemek için ekranın sol alt kısmındaki şekilleri seçin. Ardından sağ alttaki sütunları seçin. Ardından şekil boyutunu belirlemek için yükseklik ve genişlik sütunları ekleyin.
Son olarak, şekli adlandırın ve yineleyin. Tüm bölgeler örnekledikten sonra, sütunlar sekmesinden elde edilen verilerin birleştirilmesi ve çözümlenmesi ile devam edin. Bu protokolün işe yaradığını doğrulamak için beyin bölümleri primer ve sekonder antikorlar, tek başına ikincil antikor veya ne primer ne de sekonder antikor ile kuluçkaya yatırıldı.
Dorsal hipokampus ve amigdalada beyin dokusuna hem primer hem de sekonder antikorlar uygulandığında ani erken gen c-jun ekspresyonu saptanır. AMPA reseptörünün GluR1 alt birimi ve NMDA reseptörünün NR2A alt birimi amigdala çekirdeklerinde dışkı proteini tespitinde saptandı. Bu öğrenme ve bellek nörobiyolojik bir imza olan amigdala alt çekirdeklerinde AMPA NMDA reseptörlerinin oranı incelenmesine izin verdi.
Ventral hipokampustaki yüksek çözünürlüklü taramalar sonucunda ortalama ve normalleştirilmiş protein ekspresyonu ölçütleri elde edilebildi. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak, bir dikdörtgen ilgi bölgesine yerleştirilir ve şekil ışık ortalama yoğunluğu protein ifade ölçüsü olan florofor ifade, bir ölçü olarak kullanılmıştır. Normalleştirilmiş eğriyi elde etmek için, yüksek sinyal ifade eden bir bölge boyunca bir şekil yerleştirildi ve eğrinin altındaki bölgede düşük sinyal protein ifadesinin bir ölçüsü olarak kullanıldı.
Bu prosedür ile en büyük mücadele bir antikor bulma ve çalıştığından emin olmaktır. Uygulama basittir. Benim tavsiyem ilk düzenli bir immünohistokimyasal işlem girişimi, daha sonra bu tekniği deneyin olacaktır.
Her zaman önce bir doğrulama tonu gerçekleştirin. Hatırlanması gereken en önemli şey antikor seyreltme kontrol etmek ve doğru uygulandığından emin olmaktır. Bu adımlar olmadan, yordam başarısız olur.
