巨噬细胞吞噬胸腺细胞吞噬的实验分析

我们的身体每天产生100亿到100亿个凋亡细胞。这些电池的高效清除有助于清除细胞碎片并维持库存。这种方法可用于许多应用，以描述凋亡细胞结合和摄入许多其他噬细胞类型。

演示这个程序的将是我实验室的高级技师郑宇轩。要收获胸腺细胞，打开一只天真的C57黑色6鼠标的胸腔后，使用弯曲的细尖钳拉出胸腺。将器官放入含有10毫升RPMI 1640中等的组织培养盘中。

将整个胸腺磨碎在两个显微镜幻灯片的磨砂端上，并通过 70 微米细胞过滤器将产生的组织悬浮液过滤到 50 毫升管中。通过离心收集胸腺细胞，并在40毫升中重新暂停颗粒。计数后，再次离心细胞，每50毫升管20毫升新鲜PBS中，将2倍10重新向8个细胞重新暂停。

将细胞与5微摩尔CFSE标注每管20毫升PBS。在室细胞孵育时，在室温下将胸腺细胞孵育不超过两分钟，然后反转管子两到三次，以混合。在孵育结束时，停止与10毫升热灭活马血清的反应，通过离心收集细胞。

将标记的细胞重新用 40 毫升新鲜 PBS 中重新暂停，用于计数和离心，然后用 40 毫升的介质进行额外的洗涤。中等洗涤后，将胸腺细胞以每毫升组织培养培养力的7倍10重新暂停至6个细胞，并在100毫米组织培养皿中播种细胞。然后以一微摩尔最终浓度将葡萄球菌加入细胞培养，并将板放在组织培养培养箱中四小时。

对于腹膜巨噬细胞分离，在第5天打开腹部皮肤而不干扰腹腔内，将两只C57黑6小鼠注射一毫升3%的白细胞酸酯，而不干扰腹腔。要冲洗腹腔，请使用装有 18 量针的 10 毫升注射器快速将 10 毫升洗涤缓冲液推入腔中，然后缓慢吸气洗涤缓冲液以收集到 50 毫升管中。用 PBS 清洗近体熔岩两次。

将足科巨噬细胞以每毫升组织培养中浓度的2倍10重新吸收至6个细胞。下一种子500微升的巨噬细胞进入24井板的每个井，并放置板在组织培养箱两个小时。在孵育结束时，吸上经剂去除漂浮细胞，并在每井中加入500微升组织培养。

立即将培养物中500微升的6个胸腺细胞的0至12倍10添加到培养物的每个井中，并将板放在组织培养培养箱中4小时。在孵育结束时，用新鲜的PBS清洗每井两次，以去除任何自由浮动凋亡细胞，然后用染色缓冲液洗一次。接下来，用200微升染色缓冲液为板装巨噬细胞贴上标签，每井辅以适当的抗CD11b抗体，将板在4摄氏度下放置20分钟。

在这个具有代表性的实验中，高达30%的硫化细胞刺激的内酮性巨噬细胞在CFSE通道中显示出一个阳性信号，表明这些噬菌体摄入了CFSE标记的凋亡细胞。对凋亡细胞的巨噬细胞吞没的微观观察对于研究巨噬细胞摄入凋亡细胞的能力至关重要，因为CFSE正巨噬细胞在右下象限中扩散，因为强度不同，表明单个巨噬细胞内的凋亡细胞数量不同。凋亡细胞与巨噬细胞的比例越高，不仅增加了摄入凋亡细胞的巨噬细胞数量，而且提高了巨噬细胞摄入更多凋亡细胞的能力。

在另一组实验中，当CFSE将标记的凋亡胸腺细胞添加到巨噬细胞培养物中4小时，表明这些巨噬细胞是噬菌体时，大约15%的巨噬细胞成为CFSE阳性。Mer抗体以剂量依赖的方式阻断巨噬细胞增多症，在目前环境中，整体阻塞可能占到紫外细胞病效率的30%左右。此外，新批准的TAM受体抑制剂以剂量依赖的方式衰减巨噬细胞增多，浓度高达约100纳米摩尔。

始终记得检查凋亡细胞的百分比，因为这个数字直接影响到肺功能化的效率。噬菌体巨噬细胞可以通过西方的污点进一步分析，以研究由吞没过程和显微镜调节的信号分子，以研究吞没的动力学。