Il nostro corpo genera da uno a 10 miliardi di cellule apoptotiche ogni giorno. L'efficiente clearance di queste cellule aiuta a rimuovere i detriti cellulari e a mantenere gli inventari. Questo metodo può essere usato in molte applicazioni per caratterizzare il legame e l'ingestione di cellule apoptotiche da molti altri tipi di cellule fagocitiche.
A dimostrare questa procedura sarà Yuxuan Zhen, un tecnico senior nel mio laboratorio. Per raccogliere i timociti, dopo aver aperto la cavità toracica di un ingenuo topo C57 nero 6, utilizzare forcette curve a punta fine per estrarre il timo. Mettere l'organo in un piatto di coltura tissutale contenente 10 millilitri di RPMI 1640 Medium.
Macinare l'intero timo contro le estremità smerigliate di due vetrini del microscopio e filtrare la sospensione tissutale risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Raccogliere i timociti mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 40 millilitri. Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e rimorsi fino a due volte 10 alle otto cellule in 20 millilitri di PBS fresco per tubo da 50 millilitri.
Etichettare le celle con cinque CFSE micromolare in 20 millilitri di PBS per tubo. Invertire i tubi da due a tre volte per mescolare prima di incubare i timociti per non più di due minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, interrompere la reazione con 10 millilitri di siero di cavallo inattivato dal calore e raccogliere le cellule per centrifugazione.
Resuspend le cellule etichettate in 40 millilitri di PBS fresco per il conteggio e la centrifugazione seguita da un lavaggio aggiuntivo con 40 millilitri di mezzo. Dopo il lavaggio medio, risosopendare i timociti a un sette per 10 alle sei cellule per millilitro della concentrazione media di coltura tissutale e seminare le cellule in un piatto di coltura tissutale di 100 millimetri. Quindi aggiungere la staurosporina alla coltura cellulare a una concentrazione finale micromolare e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per quattro ore.
Per l'isolamento macrofago peritoneale, iniettare due topi C57 neri 6 intraperitonealmente con un millilitro di tioglicollato invecchiato al 3% al giorno zero prima di aprire la pelle addominale senza disturbare il peritoneo il quinto giorno. Per lavare la cavità peritoneale, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18 per spingere rapidamente 10 millilitri di tampone di lavaggio nella cavità prima di aspirare lentamente il tampone di lavaggio per la raccolta in un tubo da 50 millilitri. Lavare la lavanda peritoneale due volte con PBS.
Resospendare i macrofagi peritoneali a una concentrazione media di coltura tissutale due volte 10 a sei cellule per millilitro. Seme successivo 500 microlitri di macrofagi in ogni pozzo di una piastra di 24 pozza e posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per due ore. Alla fine dell'incubazione, aspirare il supernatante a rimuovere le cellule galleggianti e aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura tissutale ad ogni pozzo.
Aggiungere immediatamente zero a 12 per 10 ai sei timociti in 500 microlitri di mezzo ad ogni pozzo della coltura e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura tissutale per quattro ore. Al termine dell'incubazione, lavare ogni bene due volte con PBS fresco per rimuovere eventuali cellule apoptotiche galleggianti libere seguite da un singolo lavaggio con tampone di colorazione. Etichettare successivamente i macrofagi legati alla piastra con 200 microlitri di tampone di colorazione integrati con un anticorpo anti-CD11b appropriato per pozzo e posizionare la piastra a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
In questo esperimento rappresentativo, fino al 30% dei macrofagi peritoneali stimolati dal tioglicollato hanno dimostrato un segnale positivo nel canale CFSE che indica che questi fagociti avevano ingerito cellule apoptotiche etichettate CFSE. L'osservazione microscopica dell'inghiottimento di macrofagi delle cellule apoptotiche è essenziale per studiare la capacità dei macrofagi di ingerire cellule apoptotiche come macrofagi positivi CFSE sparsi nel quadrante in basso a destra a causa di diverse intensità che indicano che il numero di cellule apoptotiche all'interno dei singoli macrofagi è diverso. Un rapporto più elevato tra cellule apoptotiche e macrofagi non solo aumenta il numero di macrofagi che ingeriscono cellule apoptotiche, ma migliora anche la capacità dei macrofagi di ingerire cellule più apoptotiche.
In un'altra serie di esperimenti, circa il 15% dei macrofagi divenne positivo al CFSE quando il CFSE etichettato timociti apoptotici fu aggiunto alla coltura del macrofago per quattro ore indicando che questi macrofagi erano i macrofagi fagocitici. L'anticorpo Mer blocca l'efferocitosi macrofagia in modo dose-dipendente e il blocco complessivo può rappresentare circa il 30% dell'efficienza dell'efferocitosi nell'ambiente attuale. Inoltre, un inibitore del recettore TAM appena approvato attenua l'efferocitosi del macrofago in modo dose-dipendente fino a una concentrazione di circa 100 nanomolare.
Ricorda sempre di controllare la percentuale di cellule apoptotiche poiché questo numero influisce direttamente sull'efficienza dell'efferocitosi. I macrofagi fagocitici possono essere ulteriormente analizzati dalla macchia occidentale per indagare le molecole di segnalazione regolate dal processo di inghiottimento e dalla microscopia per studiare la dinamica dell'inghiottimento.
