Notre corps génère de 1 à 10 milliards de cellules apoptotiques chaque jour. Le dégagement efficace de ces cellules aide à enlever les débris cellulaires et à maintenir les stocks. Cette méthode peut être utilisée dans de nombreuses applications pour caractériser la liaison cellulaire apoptotique et l’ingestion par de nombreux autres types de cellules phagocytiques.
Yuxuan Zhen, technicien senior dans mon laboratoire, démontrera cette procédure. Pour récolter les thymocytes, après avoir ouvert la cavité thoracique d’une souris C57 noire naïve de 6, utilisez des forceps incurvés pour retirer le thymus. Placer l’organe dans un plat de culture tissulaire contenant 10 millilitres de RPMI 1640 Medium.
Moudre le thymus entier contre les extrémités givrées de deux lames de microscope et filtrer la suspension tissulaire résultante à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Recueillir les thymocytes par centrifugation et réutiliser la pastille en 40 millilitres. Après comptage, centrifuger les cellules à nouveau et resuspendre jusqu’à deux fois 10 à huit cellules dans 20 millilitres de PBS frais par tube de 50 millilitres.
Étiquetez les cellules avec cinq micromolaires CFSE en 20 millilitres de PBS par tube. Inverser les tubes deux à trois fois pour les mélanger avant d’incuber les thymocytes pendant au plus deux minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, arrêter la réaction avec 10 millilitres de sérum de cheval inactivé par la chaleur et recueillir les cellules par centrifugation.
Resuspendez les cellules étiquetées en 40 millilitres de PBS frais pour le comptage et la centrifugation suivies d’un lavage supplémentaire avec 40 millilitres de milieu. Après le lavage moyen, résuspendez les thymocytes à sept fois 10 aux six cellules par millilitre de concentration moyenne de culture tissulaire et ensemencez les cellules dans un plat de culture tissulaire de 100 millimètres. Ajouter ensuite la staurosporine à la culture cellulaire à une concentration finale d’un micromolaire et placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant quatre heures.
Pour l’isolement péritonéal de macrophage, injectez deux souris noires de C57 6 intraperitoneally avec un millilitre de thioglycollate 3%aged au jour zéro avant d’ouvrir la peau abdominale sans déranger le péritoine le cinquième jour. Pour rincer la cavité péritonéale, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 18 pour pousser rapidement 10 millilitres de tampon de lavage dans la cavité avant d’aspirer lentement le tampon de lavage pour la collecte dans un tube de 50 millilitres. Laver le lavage péritonéal deux fois avec PBS.
Resuspendez les macrophages péritonéaux à deux fois 10 aux six cellules par millilitre de concentration moyenne de culture tissulaire. Graines suivantes 500 microlitres de macrophages dans chaque puits d’une plaque de puits 24 et placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant deux heures. À la fin de l’incubation, aspirer le supernatant pour enlever les cellules flottantes et ajouter 500 microlitres de milieu de culture tissulaire à chaque puits.
Ajouter immédiatement zéro à 12 fois 10 aux six thymocytes dans 500 microlitres de milieu à chaque puits de la culture et placer la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant quatre heures. À la fin de l’incubation, laver chaque puits deux fois avec du PBS frais pour enlever les cellules apoptotiques flottantes libres suivies d’un seul lavage avec tampon de coloration. Étiquette suivante les macrophages liés à la plaque avec 200 microlitres de tampon de coloration complétés par un anticorps anti-CD11b approprié par puits et placent la plaque à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Dans cette expérience représentative, jusqu’à 30% des macrophages péritonéaux stimulés de thioglycollate ont démontré un signal positif dans le canal de CFSE indiquant que ces phagocytes avaient ingéré des cellules apoptotiques CFSE-étiquetées. L’observation microscopique de l’engloutissement de macrophage des cellules apoptotiques est essentielle pour étudier la capacité des macrophages à ingérer des cellules apoptotiques pendant que les macrophages positifs de CFSE se répandent dans le quadrant inférieur droit dû aux intensités différentes indiquant que le nombre de cellules apoptotiques dans les macrophages individuels est différent. Un rapport plus élevé des cellules apoptotiques aux macrophages augmente non seulement le nombre de macrophages ingérant des cellules apoptotiques, mais améliore également la capacité des macrophages à ingérer des cellules plus apoptotiques.
Dans une autre série d’expériences, environ 15% des macrophages sont devenus positifs cfse quand CFSE étiqueté thymocytes apoptotiques ont été ajoutés à la culture de macrophage pendant quatre heures indiquant que ces macrophages étaient les macrophages phagocytiques. L’anticorps mer bloque l’efférocytose macrophage d’une manière dépendante de la dose et le blocage global peut représenter environ 30% de l’efficacité de l’efférocytose dans le contexte actuel. En outre, un inhibiteur des récepteurs TAM nouvellement approuvé atténue l’efférocytose macrophage d’une manière dépendante de la dose jusqu’à une concentration d’environ 100 nanomolaires.
N’oubliez pas de vérifier le pourcentage de cellules apoptotiques car ce nombre affecte directement l’efficacité de l’efférocytose. Les macrophages phagocytiques peuvent être analysés par tache occidentale pour étudier les molécules de signalisation régulées par le processus d’engloutissement et par microscopie pour étudier la dynamique de l’engloutissement.
