Наше тело генерирует от одного до 10 миллиардов апоптотических клеток каждый день. Эффективное очистка этих клеток помогает в удалении клеточного мусора и поддержании запасов. Этот метод может быть использован во многих приложениях для характеристики апоптотических клеток связывания и приема пищи многими другими типами фагоцитных клеток.
Демонстрацией этой процедуры будет Yuxuan Чжэнь, старший техник в моей лаборатории. Для сбора тимоцитов, после открытия грудной полости наивной C57 черный 6 мыши, использовать изогнутые тонкие миппы кончика, чтобы вытащить тимуса. Поместите орган в блюдо культуры тканей, содержащее 10 миллилитров RPMI 1640 Medium.
Измельчить весь тимус против матовых концов двух слайдов микроскопа и фильтровать в результате подвески ткани через 70 микрометровый ситечко клеток в 50 миллилитровую трубку. Соберите тимоциты путем центрифугации и повторное производство гранул в 40 миллилитров. После подсчета, центрифуга клеток снова и повторно до двух раз 10 до восьми клеток в 20 миллилитров свежего PBS на 50 миллилитров трубки.
Этикетка клеток с пятью микромолярной CFSE в 20 миллилитров PBS на трубку. Инвертировать трубки два-три раза, чтобы смешать перед инкубацией тимоцитов в течение не более двух минут при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации остановите реакцию 10 миллилитров тепловой инактивированной конной сыворотки и соберите клетки путем центрифугации.
Resuspend помеченных клеток в 40 миллилитров свежих PBS для подсчета и центрифугации следуют дополнительные мыть с 40 миллилитров среды. После среды мытья, повторно использовать тимоциты в семь раз от 10 до шести клеток на миллилитр ткани культуры средней концентрации и семян клеток в 100 миллиметров ткани культуры блюдо. Затем добавьте стауроспорин в клеточную культуру в одной микромоляной конечной концентрации и поместите пластину в инкубатор культуры тканей в течение четырех часов.
Для перитонеальной макрофаг изоляции, вводить два C57 черный 6 мышей intraperitoneally с одним миллилитр 3% в возрасте thioglycollate в день нуля, прежде чем открыть брюшную кожу, не нарушая брюшной полости на пятый день. Чтобы промыть брюшную полость, используйте 10 миллилитровый шприц, оснащенный иглой 18 калибра, чтобы быстро протолкнуть 10 миллилитров буфера мытья в полость, прежде чем медленно аспирировать буфер стирки для сбора в 50 миллилитровую трубку. Вымойте брюшной промывки два раза с PBS.
Resuspend перитонеальные макрофаги в два раза от 10 до шести клеток на миллилитр ткани культуры средней концентрации. Следующее семя 500 микролитров макрофагов в каждый колодец из 24 хорошо пластины и поместить пластину в инкубатор культуры тканей в течение двух часов. В конце инкубации, аспирировать супернатант, чтобы удалить плавающие клетки и добавить 500 микролитров ткани культуры среды к каждому хорошо.
Немедленно добавьте ноль до 12 раз 10 к шести тимоцитов в 500 микролитров среднего к каждому колодец культуры и поместите пластину в инкубатор культуры тканей в течение четырех часов. В конце инкубации, мыть каждый хорошо два раза со свежим PBS, чтобы удалить любые свободно плавающие апоптотические клетки следуют одной стирки с окрашиванием буфера. Следующая метка пластины связанных макрофагов с 200 микролитров окрашивания буфера дополняется соответствующим анти-CD11b антитела на колодец и место пластины на четыре градуса по Цельсию в течение 20 минут.
В этом репрезентативном эксперименте до 30% тиогликолата стимулировали перитонеальные макрофаги продемонстрировали положительный сигнал в канале CFSE, указывающий на то, что эти фагоциты проглотили CFSE помеченные апоптотические клетки. Микроскопическое наблюдение за поглощением макрофагов апоптотических клеток имеет важное значение для исследования способности макрофагов поглощать апоптотические клетки, поскольку положительные макрофаги CFSE распространяются в правом нижнем квадранте из-за различной интенсивности, указывающей на то, что количество апоптотических клеток в отдельных макрофагах отличается. Более высокое соотношение апоптотических клеток к макрофагам не только увеличивает количество макрофагов, проглатющих апоптотические клетки, но и повышает способность макрофагов к более апоптотических клетках.
В другом наборе экспериментов, около 15% макрофагов стал CFSE положительным, когда CFSE помечены апоптотических тимоцитов были добавлены в макрофаг культуры в течение четырех часов, указывая, что эти макрофаги были фагоцитные макрофаги. Mer антитела блокирует макрофаг эффероцитоз в дозе зависимой образом и общая блокировка может соц-около 30% эффективности эффероцитоза в текущей обстановке. Кроме того, недавно утвержденный ингибитор рецепторов TAM затуманивает макрофаг эффероцитоз в зависимости от дозы образом до около 100 наномолярной концентрации.
Всегда помните, чтобы проверить процент апоптотических клеток, как это число непосредственно влияет на эффективность эффероцитоза. Фагоцитные макрофаги могут быть дополнительно проанализированы западным пятном для исследования сигнальных молекул, регулируемых процессом поглощения, и микроскопией для изучения динамики поглощения.
