用心脏灌注和二固定仪对脑和垂体血管进行标记

这个程序的总体目标是标记血管在大脑和垂体远程鱼，我们使用心脏灌注与固定含有DII的模型物种Medaka。因此，这种简单而高效的技术将有助于回答有关脑血管解剖和电传鱼垂体以及神经元或内分泌细胞和血管之间的关系的重要问题。该技术的一些优点包括快速和简单的制备，以及其适应远程鱼种。

要准备鱼架，请将一块聚苯乙烯切成五厘米长、三厘米宽、两厘米厚，然后将聚苯乙烯粘在直径九厘米的塑料盘上。然后用手术刀在聚苯乙烯上做一个三厘米的船形孔。要准备灌注系统，在灌注系统针头的四肢添加一个30至50厘米长的塑料管。

要准备五厘米玻璃移液器，请使用移液器拉拔器根据制造商的说明拉伸单个玻璃毛细管。在开始解剖之前，用准备好的 DII 固定溶液加载 10 毫升注射器，并在注射器的四肢放置带针的针。然后使用几块不同方向的胶带将注射器固定在长凳上，并调整显微镜和座椅的位置，以获得解剖和用肘部按注射器活塞的很好的位置。

接下来，将一条安乐死鱼放在鱼架腹部的一侧向上，用针固定头部和尾部。使用剪刀水平切割皮肤的浅层，打开前腹部，并使用钳子去除心脏上方的皮肤，直到获得心灵室和动脉球茎的清晰进入。在毛细管的四肢添加一个玻璃管，然后打碎移液器的尖端。

将玻璃管靠近心室，向注射器活塞添加肘部压力，以迫使液体排出，同时用移液器固定心室。然后立即用钳子打鼻窦，使血液从血液循环中释放。从心室，调整玻璃移液器的角度，以找到球茎动脉的入口，并移动移液器打开内球茎动脉。

然后向注射器增加压力 30 到 60 秒，同时将移液器留在球茎动脉内。为了优化所有血管的标记，至关重要的是，在球茎动脉中花足够长的时间，用DII固定溶液取代所有的血液。灌注约60秒后，当不再观察到血液渗漏时，从鱼中取出玻璃移液器和针头，将大脑和垂体收获成新鲜的4%甲醛，在黑暗中室温下两小时。

然后每次洗涤用新鲜 PBS 冲洗两次组织，10 分钟，然后准备样品进行成像。如证明，心脏注射含有DiI的固定溶液后，可以通过荧光立体显微镜或在组织切片上通过共和显微镜观察标记的血管。请注意，如果溶液注射在心室而不是动脉球茎中，或者如果溶液注入的压力过低和/或时间过短，则观察到血管标签不充分。

此外，当使用相同的成像参数对同一组织进行成像时，几天后可以观察到标记强度的降低，信号在组织样本中出现更多的扩散。组织切片从转基因线，其中感兴趣的细胞表达荧光记者蛋白可以进一步标记为特定感兴趣的蛋白质使用标准的免疫荧光协议，允许调查血管与其他细胞类型的相互作用。重要的是要达到球茎动脉。

当达到此目的时，向注射器活塞增加压力应导致球茎膨胀，以确认成功程序。这种技术可用于研究电传体垂体内分泌细胞和血管之间的相互作用，但也许更具体地用于研究电传和哺乳动物的门户系统之间的可能差异或相似性。因为这种政治用途有毒和挥发性化合物预防措施，如使用防毒面具和通风室时，应始终采取执行这些程序。