המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג את כלי הדם במוח ובמוח של דגי טלוסט, ואנחנו משתמשים בזיבול לב עם תיקון המכיל DiI בזן המודל מדאקה. אז טכניקה זו היא פשוטה ויעילה תסייע לענות על שאלות חשובות לגבי האנטומיה של כלי הדם במוח ובמוח של דגי טלוסט, כמו גם את הקשר בין נוירונים או תאים אנדוקריניים וכלי דם. כמה יתרונות של טכניקה זו כוללים הכנה מהירה ופשוטה, ואת הסתגלותה למין הדגים טלוסט.
כדי להכין מחזיק דגים, חותכים חתיכת פוליסטירן לאורך של חמישה סנטימטרים, רוחב של שלושה סנטימטרים ועובי של שני סנטימטרים, ולהדביק את הפוליסטירן לצלחת פלסטיק בקוטר תשעה סנטימטרים. ואז להשתמש באזמל כדי להפוך את סירה שלושה סנטימטר בצורת חור בפוליסטירן. כדי להכין את מערכת חליטה, להוסיף 30 עד 50 ס"מ צינורית פלסטיק ארוכה בגפיים של מחט מערכת חיסון.
כדי להכין חמש פיפטים זכוכית סנטימטר, להשתמש מושך פיפטה למתוח נימי זכוכית בודדים על פי הוראות היצרן. לפני תחילת הניתוח, לטעון מזרק 10 מיליליטר עם הפתרון מוכן DiI-fixative ולהמקם מחט עם cannula בגפיים של המזרק. לאחר מכן השתמש בכמה חתיכות של סרט הדבקה להציב אוריינטציות שונות כדי לתקן את המזרק לספסל, ולהתאים את המיקום של המיקרוסקופ ואת המושב כדי לקבל עמדה טובה עבור ניתוח עבור לחיצה על בוכנה מזרק עם המרפק.
לאחר מכן, מניחים דג המתת סנפיר בצד הבטן של מחזיק הדגים ומאבטחים את הראש והזנב עם סיכות. השתמש במספריים כדי לחתוך אופקית את השכבה השטחית של העור כדי לפתוח את הבטן הפנימית, ולהשתמש במקלפים כדי להסיר את העור מעל הלב עד גישה ברורה החדר ואת העורקים בולבוס מושגת. מוסיפים צינור זכוכית בקצה נימי ולשבור את קצה פיפטה.
להביא את צינור הזכוכית קרוב החדר ולהוסיף לחץ מרפק לבוכנה מזרק כדי לאלץ את הנוזל החוצה תוך הצמדת החדר הלב עם פיפטה. ואז מיד לחטא את הסינוס ונוסוס עם מטלאים כדי לשחרר את הדם מהמחזור. מן החדר, להתאים את הזווית של פיפטה זכוכית כדי לאתר את הכניסה של טרטרוסוס בולבוס, ולהזיז את פתח פיפטה בתוך העורקים bulbus.
לאחר מכן להוסיף לחץ על המזרק במשך 30 עד 60 שניות נוספות תוך שמירה על פיפטה בתוך העורקים bulbus. עבור תיוג אופטימלי של כל כלי הדם זה קריטי כדי לתפוש לתוך העורקים בולבוס מספיק זמן כדי להחליף את כל הדם עם פתרון DiI-fixative. לאחר כ -60 שניות של זלוף, כאשר לא נצפתה עוד דליפת דם, הסר את פיפטה הזכוכית והמחטים מהדגים, וקצר את המוח ואת בלוטת יותרת המוח לתוך טרי 4% paraformaldehyde במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך.
לאחר מכן לשטוף את הרקמות פעמיים PBS טרי במשך 10 דקות לכל לשטוף לפני הכנת הדגימות להדמיה. לאחר הזרקת לב של פתרון קיבוע המכיל DiI כפי שהודגם, כלי הדם המסומנים ניתן לראות על פרוסות רקמות על ידי מיקרוסקופיה סטריאו פלואורסצנטי או על רקמות שלמות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקאלית. שים לב שאם הפתרון מוזרק בחדר הלב במקום טרקי העורקים בולבוס או אם הפתרון מוזרק עם נמוך מדי של לחץ ו / או לתקופה קצרה מדי, תיוג לקוי של כלי הדם יצפה.
בנוסף, כאשר מדמיינים את אותה רקמה עם אותם פרמטרי הדמיה, ניתן לראות ירידה בעוצמת התיוג לאחר מספר ימים, כאשר האות מופיע מתפשט יותר בתוך דגימת הרקמה. פרוסות רקמה מקווים מהוססים שבתוכם התאים בעלי העניין מבטאים חלבוני כתב פלואורסצנטיים יכולים להיות מסומנים עוד יותר עבור חלבונים ספציפיים של עניין באמצעות פרוטוקולי immunofluorescence סטנדרטיים המאפשרים חקירה של אינטראקציות בין כלי דם וסוגי תאים אחרים. חשוב להגיע לתרקוס בולבוס.
כאשר זה מושגת, הוספת לחץ לבוכנה מזרק צריך לגרום הרחבה של בולבוס המאשר הליך מוצלח. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין תאים אנדוקריניים וכלי דם בלוטת יותרת המוח טלוסט בכלל, אבל אולי באופן ספציפי יותר כדי לחקור הבדלים אפשריים או קווי דמיון בין מערכות הפורטל בטלוסט ויונקים. מכיוון ששימוש פוליטי זה תרכובות רעילות ונדיפות אמצעי זהירות כגון שימוש במסכת גז וחדר מאוורר תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליכים אלה.
