Общая цель этой процедуры заключается в маркировке кровеносных сосудов в головном мозге и гипофиза рыбы телеоста, и мы используем сердечную перфузию с фиксатором, содержащим DiI в модели вида медака. Так что этот метод, который прост и эффективен, поможет ответить на важные вопросы, касающиеся сосудистой анатомии в головном мозге и гипофиза рыбы телеоста, а также взаимосвязи между нейронами или эндокринными клетками и кровеносными сосудами. Некоторые преимущества этой техники включают быстрый и простой препарат, и его приспособляемость к телеост видов рыб.
Чтобы подготовить держатель рыбы, вырезать кусок полистирола до пяти сантиметров в длину, три сантиметра шириной и толщиной два сантиметра, и клей полистирола до девяти сантиметров в диаметре пластиковой тарелки. Затем используйте скальпель, чтобы сделать трехметровую лодку в форме отверстия в полистирола. Для подготовки перфузионой системы добавьте пластиковую канюлю длиной от 30 до 50 сантиметров на конечности иглы перфузионой системы.
Для подготовки пятиметровых стеклянных пипеток используйте пипетку для растяжения отдельных стеклянных капилляров в соответствии с инструкциями производителя. Перед началом вскрытия загрузите шприц 10 миллилитров с подготовленным диИ-фиксаторным раствором и поместите иглу с канюлей на конечность шприца. Затем используйте несколько кусков ленты, помещенных в различные ориентации, чтобы зафиксировать шприц на скамейке, и настроить положение микроскопа и сиденья, чтобы получить хорошее положение для вскрытия и для нажатия поршня шприца локтем.
Затем поместите усыпанную рыбу в живот держателя рыбы вверх и закрелите голову и хвост булавками. Используйте ножницы, чтобы горизонтально сократить поверхностный слой кожи, чтобы открыть переднюю часть живота, и использовать миппы, чтобы удалить кожу над сердцем, пока не будет достигнут четкий доступ к желудочков и луковичных артерий. Добавьте стеклянную трубку в конечности капилляра и разбейте кончик пипетки.
Принесите стеклянную трубу близко к желудолю и добавьте давление локтя к поршню шприца для того чтобы принудрить жидкость вне пока зажимая желудочек сердца с pipette. Затем сразу перфорировать синус венозус с типсами, чтобы освободить кровь от кровообращения. Из желудочка, отрегулируйте угол стеклянной пипетки, чтобы найти вход в артерии луковицы, и переместить пипетки открытия внутри лампочки артерий.
Затем добавьте давление на шприц в течение дополнительных 30 до 60 секунд, сохраняя при этом пипетки внутри артерии луковичного. Для оптимальной маркировки всех кровеносных сосудов очень важно, чтобы пролиться в луковичный артерий достаточно долго, чтобы заменить всю кровь с DiI-фиксативным раствором. Примерно через 60 секунд перфузии, когда больше не наблюдается утечки крови, удалить стеклянную пипетку и иглы из рыбы, и урожай мозга и гипофиза в свежем 4%paraformaldehyde в течение двух часов при комнатной температуре в темноте.
Затем промыть ткани два раза в свежем PBS в течение 10 минут за стирку перед подготовкой образцов для визуализации. После сердечной инъекции фиксаторного раствора, содержащего DiI, как попродемонстрировано, помеченные кровеносные сосуды могут наблюдаться на ломтиках тканей флуоресцентной стерео микроскопией или на цельной ткани с помощью конфокальной микроскопии. Обратите внимание, что если раствор вводится в желудочек сердца, а не луковичный артерий или если раствор вводится с слишком низким давлением и / или слишком короткий период, неадекватная маркировка сосудов будет наблюдаться.
Кроме того, при визуализации одной и той же ткани с теми же параметрами изображения, снижение интенсивности маркировки можно наблюдать через несколько дней, с сигналом появляется более распространения в образце ткани. Ткань ломтиками из трансгенных линий, в пределах которых клетки, представляющие интерес выразить флуоресцентные белки репортера могут быть дополнительно помечены для конкретных белков, представляющих интерес с помощью стандартных протоколов иммунофлуоресценции позволяет исследование взаимодействий между кровеносными сосудами и другими типами клеток. Важно, чтобы достичь луковичный артерий.
Когда это достигается, добавление давления на поршень шприца должно вызвать расширение луковичного, подтверждающего успешную процедуру. Этот метод может быть использован для исследования взаимодействия между эндокринными клетками и кровеносными сосудами в гипофиза телеоста в целом, но, возможно, более конкретно для изучения возможных различий или сходства между системами портала в телеосте и млекопитающих. Потому что это политическое использование токсичных и летучих соединений меры предосторожности, такие как использование противогаза и вентилируемой комнате всегда должны быть приняты при выполнении этих процедур.
