الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية الأوعية الدموية في الدماغ وخامة من الأسماك التيليوست، ونحن نستخدم ضخ القلب مع تثبيت يحتوي على دي في الأنواع النموذجية medaka. لذا فإن هذه التقنية التي هي بسيطة وفعالة تساعد على الإجابة على الأسئلة الهامة المتعلقة بالتشريح الوعائي في الدماغ وخامة من الأسماك التي تم نشرها وكذلك العلاقة بين الخلايا العصبية أو خلايا الغدد الصماء والأوعية الدموية. وتشمل بعض مزايا هذه التقنية إعداد بسيط سريع وسهل، وقدرتها على التكيف مع أنواع الأسماك teleost.
لإعداد حامل السمك، وقطع قطعة من البوليسترين إلى طول خمسة سنتيمترات، وعرض ثلاثة سنتيمترات، وسمك اثنين سنتيمتر، والغراء البوليسترين إلى طبق بلاستيكي قطره تسعة سنتيمترات. ثم استخدام مشرط لجعل ثلاثة سنتيمترات على شكل قارب حفرة في البوليسترين. لتحضير نظام التسريب، أضف قنية بلاستيكية طولها 30 إلى 50 سنتيمترًا عند أقصى إبرة نظام الضخ.
لإعداد خمسة ماصات زجاجية سنتيمتر، استخدم سحب ماصة لتمدد الشعيرات الزجاجية الفردية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قبل البدء في تشريح، تحميل حقنة 10 ملليلتر مع الحل دي التثبيتية أعدت ووضع إبرة مع قنية في الطرف الأقصى من الحقنة. ثم استخدم عدة قطع من الشريط وضعت في اتجاهات مختلفة لإصلاح الحقنة إلى مقاعد البدلاء، وضبط موقف المجهر والمقعد للحصول على وضع جيد للتشريح والضغط على المكبس الحقنة مع الكوع.
المقبل، ووضع سمكة القتل الرحيم في الجانب صاحب السمك البطن حتى وتأمين الرأس والذيل مع دبابيس. استخدم المقصات لقطع الطبقة السطحية من الجلد أفقيًا لفتح البطن الأمامي، واستخدم ملقطًا لإزالة الجلد فوق القلب حتى يتحقق الوصول الواضح إلى البطين والشراي لمبة. إضافة أنبوب زجاجي في أقصى شعري وكسر غيض من الماصة.
جلب الأنابيب الزجاجية قريبة من البطين وإضافة ضغط الكوع إلى المكبس حقنة لإجبار السائل في حين تعلق البطين القلب مع ماصة. ثم ثقب على الفور في الجيوب الأنفية مع ملقط لتحرير الدم من الدورة الدموية. من البطين، وضبط زاوية من الماصات الزجاجية لتحديد موقع مدخل الشريانية لمبة، ونقل فتحة ماصة داخل المصابيح الشريانية.
ثم إضافة الضغط إلى حقنة لمدة إضافية 30 إلى 60 ثانية مع الحفاظ على ماصة داخل المصابيح الشريانية. لوضع العلامات الأمثل لجميع الأوعية الدموية من الأهمية بمكان أن تضخ في لمبة الشريان طويلة بما يكفي لاستبدال جميع الدم مع حل DiI-المثبت. بعد حوالي 60 ثانية من الضخ، عندما لا يتم ملاحظة تسرب الدم أكثر، وإزالة ماصة الزجاج والإبر من الأسماك، وحصاد الدماغ والنخامية في 4٪ paraformaldehyde الطازجة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ثم شطف الأنسجة مرتين في برنامج تلفزيوني جديد لمدة 10 دقائق لكل غسل قبل إعداد العينات للتصوير. بعد حقن القلب من محلول التثبيت التي تحتوي على DiI كما هو موضح، يمكن ملاحظة الأوعية الدموية المسمى على شرائح الأنسجة عن طريق المجهر ستيريو الفلورسنت أو على الأنسجة بأكملها عن طريق المجهر confocal. لاحظ أنه إذا تم حقن المحلول في بطين القلب بدلاً من المصابيح الشريانية أو إذا تم حقن المحلول بضغط منخفض جداً و/أو لفترة قصيرة جداً، سيتم ملاحظة وضع علامات غير كافية على الأوعية.
بالإضافة إلى ذلك، عند تصوير نفس النسيج بنفس معلمات التصوير، يمكن ملاحظة انخفاض في كثافة وضع العلامات بعد عدة أيام، مع ظهور إشارة أكثر انتشارًا داخل عينة الأنسجة. شرائح الأنسجة من خطوط المعدلة وراثيا داخل الخلايا ذات الاهتمام التعبير عن البروتينات مراسل الفلورسنت يمكن أن تكون أكثر المسمى لبروتينات محددة من الفائدة باستخدام بروتوكولات المناعة القياسية التي تسمح للتحقيق في التفاعلات بين الأوعية الدموية وأنواع الخلايا الأخرى. من المهم الوصول إلى المصابيح الشريانية.
عندما يتحقق ذلك، إضافة الضغط إلى المكبس حقنة ينبغي أن تحفز على توسيع لمبة تأكيد إجراء ناجح. ويمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في التفاعل بين خلايا الغدد الصماء والأوعية الدموية في الغدة النخامية التائية بشكل عام، ولكن ربما بشكل أكثر تحديدا للتحقيق في الاختلافات أو أوجه التشابه المحتملة بين أنظمة البوابة في teleost والثدييات. لأن هذا الاستخدام السياسي المركبات السامة والمتطايرة الاحتياطات مثل استخدام قناع الغاز وغرفة التهوية ينبغي دائما أن تتخذ عند تنفيذ هذه الإجراءات.
