이 절차의 전반적인 목표는 텔레오스트 물고기의 뇌와 뇌하수체에 있는 혈관을 표지하는 것입니다, 우리는 모형 종 medaka에 있는 DiI를 포함하는 고정으로 심장 관혈을 이용합니다. 그래서 간단하고 효율적인이 기술은 텔레오스트 물고기의 뇌와 뇌 하 수 체뿐만 아니라 뉴런 또는 내분비 세포와 혈관 사이의 관계에 관한 중요한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 몇 가지 장점은 빠르고 쉬운 간단한 준비, 텔레오스트 물고기 종에 대한 적응성을 포함한다.
생선 홀더를 준비하려면 폴리스티렌 조각을 5센티미터 길이, 3센티미터 너비, 2센티미터 두께로 자르고 폴리스티렌을 직경 9센티미터의 플라스틱 접시에 붙입니다. 그런 다음 메스를 사용하여 폴리스티렌에 3 센티미터 보트 모양의 구멍을 만듭니다. 관류 시스템을 준비하려면 관류 시스템 바늘의 극단에 30~50cm 길이의 플라스틱 캐뉼라를 추가합니다.
5센티미터 유리 파이펫을 준비하려면 파이펫 풀러를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 개별 유리 모세 혈관을 늘이십시오. 해부를 시작하기 전에 준비된 DiI 고정 용액으로 10 밀리리터 주사기를 적재하고 주사기의 극단에 캐뉼라로 바늘을 놓습니다. 그런 다음 다른 방향으로 배치 된 테이프의 여러 조각을 사용하여 주사기를 벤치에 고정시키고 현미경과 시트의 위치를 조정하여 해부에 적합한 위치를 얻고 팔꿈치로 주사기 피스톤을 누르는 것입니다.
다음으로, 생선 홀더 복부쪽에 안락사된 물고기를 놓고 핀으로 머리와 꼬리를 고정시세요. 가위를 사용하여 피부표면층을 수평으로 잘라 전방 복부를 열고, 집게를 사용하여 심실과 구균 동맥에 대한 명확한 접근이 이루어질 때까지 심장 위의 피부를 제거합니다. 모세관의 사지에 유리 파이프를 추가하고 파이펫의 끝을 깰.
유리 파이프를 심실 가까이 에 가져와 주사기 피스톤에 팔꿈치 압력을 추가하여 파이펫으로 심실을 고정하면서 액체를 강제로 꺼낼 수 있습니다. 그런 다음 즉시 부비동 독을 집게로 천명하여 혈액을 순환에서 방출합니다. 심실에서 유리 파이펫의 각도를 조정하여 구푸스 동맥의 입구를 찾고, 피펫개 개구부 내부의 피펫 개구부를 구불 구균 동맥 내로 이동합니다.
그런 다음 피펫을 구불 구균 동맥 내부에 유지하면서 30~60초 동안 주사기에 압력을 추가합니다. 모든 혈관의 최적의 라벨링을 위해 모든 혈액을 DiI 고정 솔루션으로 대체할 만큼 오랫동안 구불 구균 동맥으로 침투하는 것이 중요합니다. 관류의 약 60 초 후, 더 이상 혈액 누출이 관찰되지 않는 경우, 물고기에서 유리 파이펫과 바늘을 제거하고, 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 신선한 4 %의 파라 포름 알데히드로 뇌와 뇌하수체를 수확.
그런 다음 화상 진찰을 위한 견본을 준비하기 전에 세척 당 10 분 동안 신선한 PBS에서 조직을 두 번 헹구습니다. 입증된 바와 같이 DiI를 포함하는 고정용액의 심장 주입 후, 표지된 혈관은 형광 스테레오 현미경 검사법에 의해 조직 조각또는 공초점 현미경검사법에 의해 조직 조각에서 관찰될 수 있다. 용액이 구균 동맥 대신 심실에 주입되거나 용액이 너무 낮은 압력 및 /또는 너무 짧은 기간 동안 주입되는 경우 혈관의 부적절한 라벨링이 관찰됩니다.
또한, 동일한 이미징 파라미터를 가진 동일한 조직을 이미징할 때, 라벨링 강도의 감소는 며칠 후에 관찰될 수 있으며, 신호가 조직 샘플 내에서 더 확산되는 것으로 나타난다. 관심 있는 세포의 발현형 기자 단백질이 혈관과 그밖 세포 모형 사이 상호 작용의 조사를 허용하는 표준 면역 형광 프로토콜을 사용하여 관심의 특정 단백질을 위해 추가로 표지될 수 있는 내의 형질 선에서 조직 조각. 구불 구균 동맥에 도달하는 것이 중요합니다.
이 달성 될 때, 주사기 피스톤에 압력을 추가 하는 성공적인 절차를 확인 하는 전구의 확장을 유도 한다. 이 기술은 텔레오스트 뇌하수체에 있는 내분비 세포와 혈관 사이 상호 작용을 일반적으로 조사하는 데 사용될 수 있습니다, 그러나 어쩌면 더 구체적으로 텔레오스트와 포유동물의 포털 시스템 사이 가능한 다름 또는 유사성을 조사하기 위하여. 이 정치적 사용은 방독면과 환기 실을 사용하는 것과 같은 독성 및 휘발성 화합물 예방 조치를 항상 이러한 절차를 수행 할 때 취해야하기 때문입니다.
