この手順の全体的な目標は、脳内の血管とテレオスト魚の下垂体にラベルを付け、モデル種メダカにDiIを含む固定剤で心臓灌流を使用しています。だから、単純かつ効率的であるこの技術は、脳内の血管解剖学とテレオスト魚の下垂体だけでなく、ニューロンや内分泌細胞と血管の関係に関する重要な質問に答えるのに役立ちます.この技術のいくつかの利点は、迅速かつ簡単な簡単な準備、およびテレオスト魚種への適応性が含まれます。
魚のホルダーを準備するには、ポリスチレンを5センチメートルの長さ、3センチメートルの幅、2センチメートルの厚さにカットし、ポリスチレンを直径9センチメートルのプラスチック皿に接着します。その後、メスを使用してポリスチレンに3センチメートルのボートの形をした穴を作ります。灌流システムを準備するには、灌流システムの針の極端に長さ30〜50センチメートルのプラスチックカニューレを追加します。
5センチガラスピペットを準備するには、ピペットプーラーを使用して、メーカーの指示に従って個々のガラス毛細血管を伸ばします。解剖を開始する前に、準備されたDiI固定溶液で10ミリリットルの注射器をロードし、注射器の先端にカニューレ付きの針を置きます。次に、異なる方向に置かれたテープを数枚使用して、シリンジをベンチに固定し、顕微鏡とシートの位置を調整して、解剖とシリンジピストンを肘で押すのに適した位置を得ます。
次に、魚のホルダーの腹部に安楽死させた魚を上に置き、頭と尾をピンで固定します。はさみを使用して皮膚の表面層を水平に切断して前腹部を開き、心室と球根動脈への明確なアクセスが得られるまで鉗子を使用して心臓の上の皮膚を取り除きます。毛細管の先端にガラスパイプを追加し、ピペットの先端を破ります。
ガラスパイプを心室の近くに持ち込み、シリンジピストンに肘圧を加えて、心臓心室をピペットで固定しながら液体を強制的に取り出します。その後すぐに血液を循環から解放するために鉗子で静脈内静脈を穿孔する。心室から、ガラスピペットの角度を調整して動脈管球の入り口を見つけ、ピペットの開口部を球根動脈管内に移動します。
その後、ピペットを動脈動脈の中に保ちながら、さらに30〜60秒間注射器に圧力を加えます。すべての血管の最適な標識のために、すべての血液をDiI固定溶液に置き換えるのに十分な長さの動脈球根に浸透することが重要です。約60秒の灌流の後、これ以上血液漏れが見られないときは、魚からガラスピペットと針を取り出し、脳と下垂体を暗闇の中で室温で2時間新鮮な4%パラホルムアルデヒドに収穫する。
次に、サンプルをイメージング用に準備する前に、洗浄ごとに10分間、新鮮なPBSで組織を2回洗い流します。示されているようにDiIを含む固定溶液の心臓注入後、標識された血管は、蛍光ステレオ顕微鏡法によって組織スライスまたは共焦点顕微鏡によって組織全体で観察することができる。もし溶液が心臓室に注入された場合、あるいは、溶液が低圧で注入された場合や、短期間に対して、血管の不十分な標識が観察されることに注意してください。
さらに、同じ画像化パラメータを用いて同じ組織を撮像する場合、数日後に標識強度の低下が観察され、そのシグナルは組織サンプル内でより広がって現れる。目的の細胞が蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックラインからの組織スライスは、標準的な免疫蛍光プロトコルを使用して目的の特定のタンパク質に対してさらに標識することができ、血管と他の細胞タイプとの相互作用の調査を可能にする。動脈球根に到達することが重要です。
これが達成されると、シリンジピストンに圧力を加えることは、成功した手順を確認する球根の膨張を誘発するべきである。この技術は、一般的にテレオスト下垂体における内分泌細胞と血管の相互作用を調べるのに使用することができるが、テレオストと哺乳類におけるポータルシステム間の可能性のある違いや類似点を調査するためにより具体的に言えばある。この政治的な使用有毒および揮発性化合物は、ガスマスクや換気室を使用するなどの予防措置は、これらの手順を実行する際に常に取られるべきであるので。
