成人脑切片长期抑郁症诱导评估

当一个特定的蛋白质功能被基因操纵改变时，刺激性失效和运动运行损伤的协调被认为是LTS和运动学习之间因果关系的必要条件。在这里，我们演示了使用多种协议来评估DLT，这可以通过基因操纵动物的补偿机制诱导。在收获大脑之前，在冰上冷却和氧化两个50毫升的ACSF烧杯。

当溶液温度达到4摄氏度以下时，在一个冰冷烧杯中加入50微升的一毫摩尔四毒素。要收获大脑，请握住头部，用眼科剪刀沿着中线切割肤浅的皮肤。手动缩回皮肤以广泛暴露头骨表面，并使用剪刀将头骨水平地从主要的脊柱孔切割到眼睛和耳朵的上方，然后沿着两只眼睛上方的一条线切割头骨。

使用手术刀切割大脑中间的大脑，从头骨中分离出大脑的骨细胞部分，包括小脑。将样品浸入ACSF的冰冷烧杯中，并调整气泡管，使它不会搅动烧杯中的大脑块。至少7分钟后，用铲子拾起脑块，用一张滤纸吸收多余的ACSF。

用适当的医用粘合剂将组织腹侧向下安装到两厘米或两厘米的阿加片上。使用刀片尽可能切出脑组织的右半球，以与Purkinje细胞的树突状平面平行。切切和移除半球的另一边，在上优和劣等的科利库利之间切割大脑。

切断脊髓，将修剪过的小脑右侧与阿加块粘在预冷的试样托盘上。然后，倾斜试样托盘，将 ACSF 倒入样品上以固定组织并洗去多余的胶水。要切入大脑样本，请调整标本，使小脑的侧侧位于前部，并倒入足够的冰冷切片ACSF，辅以四分多毒素，以完全浸入小脑。

将气管放入切割溶液中，然后使用氧气-二氧化碳气体混合物开始冒泡。使用精细的钳子和放大镜，取出气管母体，切除小脑。去除脑干和阿加块后，旋转托盘 180 度，使小脑的后面朝向振动器的剃须刀刀片，并调整第一个切割位置。

将振动器振幅设置为 5.5，频率设置为 85 赫兹，速度设置为 3 到 4，切片厚度设置为 300 微米。获得小脑切片后，使用尼龙网将部分转移到26摄氏度水浴中的丙烯酸培养箱中，将样品完全浸入新鲜含氧ACSF中至少一小时。对于全细胞贴片夹报告，通过超定溶解ACSF中的一微摩尔皮罗毒素三分钟，然后以每分钟2毫升的流量将30摄氏度的记录室与毒素溶液一起使用。

几分钟后，将小脑切片转移到录音室，用铂金重量和尼龙线固定组织。然后用新鲜的ACSF填充刺激电极。为了刺激平行纤维，将刺激电极放在从Purkinje细胞层约50微米的分子层表面。

为了刺激攀爬纤维，将刺激电极放在Purkinje细胞层的底部，并使用微加载器将8微升0.45微升过滤钾或基于镉的内部溶液填充。在将电极浸入ACSF之前，对记录电极施加微弱的正压。电极电阻应为2至4兆欧姆，应修正液体交汇电位。

使用记录电极接近Purkinje细胞的健康明亮的细胞体，并稍微推动Purkinje细胞的表面。然后停止施加正压并施加负压，直到形成千兆孔密封。然后使用负压建立整个单元配置，将膜电位保持在负70毫伏，并在0.1赫兹下应用负2毫伏100毫秒脉冲，连续监测输入电阻、系列电阻和输入电容。

对于长期凹陷诱导，用0.1毫秒脉冲刺激分子层，并应用双脉冲刺激来识别平行纤维兴奋性后突触电流。应观察到配对脉冲促进和相对于刺激强度增加的振幅逐渐增加。要记录测试响应，请应用单个 0.1 赫兹脉冲并调整刺激的强度，使唤起的振幅在 200 皮安附近。

刺激Purkinje细胞层底部的攀爬纤维，并确定攀爬纤维激活引出的平行纤维兴奋后电流，应用双脉冲刺激。应以全或无方式观察配对脉冲抑郁，与刺激强度的增加相关。在这个具有代表性的实验中，在目前夹紧条件下，使用一个平行纤维刺激和一个爬升纤维刺激的结合在切片制备中。

结膜刺激引出的复杂尖峰的形状与攀爬纤维刺激所引出的复杂尖峰的形状相似，第一个陡峭的尖峰后跟两到三个尖峰。当一个平行纤维刺激在50毫秒后由连结二次平行和爬升纤维刺激跟随时，观察到一个类似形状的复杂尖峰。在使用基于氦的内部溶液的电压夹条件下进行的此测试中，在 50 毫秒后，同时应用第二次并联光纤刺激和体电去极化，随后进行了平行光纤刺激。

体向极化从负70到零毫伏时引出一个向内电流，尾电流在极化后也引起。最后，在电压夹条件下，在100赫兹的5个平行纤维刺激与体电去极化同时给予。同样，在去极化过程中又产生反复的内流，尾电流在极化后被引出。

为了评估小脑DLT与基因操纵动物的运动学习之间的关系，应采用多种方案在舒适的生理条件下诱导LTD。如果小脑在运动学习后在基因操纵的动物中可视化，它们之间的因果关系可以更直接地被检查。