器官细胞生存在器官细胞切片培养

有机切片培养是研究神经发育和退行或再生过程的有力工具。这种技术可用于快速筛选候选分子的神经保护潜力。与分离的原细胞培养物相比，此方法密切模仿体内条件，因为组织集体系结构和本机细胞连接保留在各部分的平面中。

在这里，我们演示了在发育中的小脑中对Purkinje细胞死亡的研究。但有机细胞切片培养同样适合在几乎每个中枢神经系统区域对神经退行性疾病进行建模。与詹妮弗·拉科托马蒙杰一起演示这个程序的将是肖恩·麦克德莫特，一个来自我实验室的技术员。

在收获小脑片之前，在消毒的生物安全柜中，用一毫升真空过滤培养基填充六孔培养板的每口井，并在治疗井中加入感兴趣的药理剂，在控制井中加入同等体积的车辆。使用无菌钳子，将一个0.4微米孔径PTFE膜过滤器插入到每口井中，注意避免每个膜和介质的界面出现气泡，并在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中平衡介质两个小时。要收获小脑，请使用直敷钳抓住幼崽头部的鼻子，并使用直眼剪刀将头皮从后部横向切开到中线。

以同样的方式切开头骨，向外指向剪刀尖，以避免损害小脑，并使用铲子将大脑转移到含有冷HBSS和每毫升葡萄糖5毫克的60毫米盘中。使用直敷料钳仔细解剖小脑，并使用无菌弯曲细钳将组织放在组织切碎器切割台上的塑料盘上。旋转切削台以定向组织，以允许获取副石部分，并向右拉表释放旋钮以移动切削台，直到刀片位于组织的边缘。

然后将切片厚度调整到 350 微米，将刀片速度调整到中等，然后启动切碎器。当整个小脑被切成片时，关闭切碎器。使用无菌钳子，将光盘放在新的 60 毫米盘上。

使用转移移液器将 HBS 和葡萄糖冲洗在光盘上，使切片落入盘中。然后，尽可能少地接触样品，使用微probe分离切片。使用转移移液器选择小脑靠近 vermis 的部分到六井板中的单个细胞培养物上，并使用微插管将切片定位到每个刀片的中心。

当所有切片都放置好时，小心吸进多余的HSS和葡萄糖，然后将板回细胞培养箱。对于免疫荧光染色，从每个井中去除上流液，用 PBS 清洗刀片。将切片与每台刀片的井中一毫升冷4%半甲醛和500微升在每台刀片顶部固定一小时。

在固定结束时，将刀片清洗四次，10分钟，每个刀片下一毫升新鲜PBS，每次在轨道摇床上清洗每个刀片的每个刀片上洗500微升新鲜PBS。用 500 微升 PBS-TB 预填充 24 孔板的每个孔，并使用画笔将每个细胞培养中的小脑切片插入到 24 孔板的单个孔中。在室温下对切片进行渗透和阻挡一小时。

在孵化结束时，在轨道摇床上，用200微升的原抗体在PBS-TB中稀释，每井过夜，温度为4摄氏度。第二天早上，在摇床上清洗4次，洗500微升新鲜PBS，然后用适当的荧光结合二次抗体在摇床的室温下将样品标记两个小时，防止光线。在孵化结束时，用每井500微升适当的核污渍对部分进行反面，在室温下10分钟，防止光线。

并使用转移移液器将切片安装到玻璃幻灯片上。然后让部分完全干燥，然后用 PBS 重新水合，然后用涂有约 80 微升安装介质的盖玻片安装组织。安装介质固化后，小脑部分即可进行成像。

在产后第六天，Purkinje细胞存活率低，在控制样本中，符合他们已知的脆弱性窗口。随着捐赠动物年龄的增长和离开这个关键时期，存活率会提高。用高浓度氯化钾处理小脑片，成功诱导其去极化和存活。

为了获得一致和可重复的结果，选择健康的小脑部分，并尽可能高效地执行培养装置设置至关重要。培养后应用超越了免疫荧光。由于有机体切片可用于基因组蛋白质表达研究，以及使用电生理学和钙活成像监测神经元回路活动。