基于 NMR 的活动测定为识别、评估和验证给定酶的抑制剂提供了一种有效的方法。它们特别适合片段筛选。NMR测定适合较弱抑制剂所需的较高化合物浓度。
此外，记者酶的缺乏使他们不容易出现假阳性。我们使用实验室中的 NMR 测定来识别和鉴定来自 Trichomonas 阴道的两种酶的抑制剂。这两种酶代表了新型抗三氯一酸药物的新靶点。
NMR测定通常适用于任何涉及酶的研究领域，甚至可用于研究细胞内的酶。该技术最重要的方面是确保正确的试剂体积被移液，反应成分被彻底混合。要准备基板和测试化合物，在四个 1.5 毫升微模糊管中每个管中加入 12 微升基板，并在零分钟控制和 30 分钟控制管中加入 6 微升的脱气 DMSO。
在第一个实验管中加入6微升试验化合物，在第二个实验管中加入3微升试验体，将3微升除臭DMSO。接下来，在含有2.59毫升反应缓冲液的15毫升管中加入300微升的氧化铝，然后是25微升的酶溶液。轻轻反转管两次，混合反应库存溶液，并在含有582微升反应库存溶液的1.5毫升管中加入10微升1.5摩尔盐酸。
然后，将反应库存溶液和酸的整个体积转移到零分钟控制管中，同时启动和淬火零分钟控制反应。以缓慢但深思熟虑的方式吸气和分配样品两次。以交错的方式启动并运行其余三种反应，立即将反应存量溶液的 582 微升转移到第一个实验管中，并将样品混合两次，正如刚刚演示的一样。
仔细的吸气和点胶可确保在启动步骤中完全混合。与每个样品保持一致，确保差分混合不是变量。30秒后，将582微升反应存量溶液转移到第二实验管并混合，然后在第二实验管中启动反应后30秒内再将582微升反应存量溶液转移到30分钟控制管。
30分钟后，在第一个实验管中加入10微升1.5摩尔盐酸，以30秒的间隔重复淬火，第二个实验管和30分钟控制管。当所有反应都淬火后，将600微升溶液从每次反应转移到核磁共振管。要计算控制光谱基板的百分比转换，请将样品加载到光谱仪上，收集 NMR 光谱，并覆盖零和 30 分钟对照的光谱。
在零分钟控制中缩放基板信号以匹配 30 分钟控制并注意此百分比。然后，将转换百分比计算为 100 减去基板信号匹配中的百分比。要计算包含测试化合物的反应基板的百分比转换，将零分钟控制光谱和包含500微摩尔试验化合物的第一反应覆盖，并在零分钟控制中缩放基板信号，使光谱与测试化合物相匹配。
请注意此百分比，并使用它计算刚才演示的转化百分比。然后，覆盖零分钟控制和包含250微摩尔试验化合物的第一反应的光谱，并在零分钟控制中缩放基板信号，使光谱与测试化合物相匹配。注意到百分比后，使用它来计算转化百分比。
要计算每个试验化合物浓度的百分比反应和百分比抑制率，首先，计算百分比反应作为测试化合物的百分比转换，除以控制时间 100 的百分比转换。然后将百分比抑制计算为 100 减去百分比反应。要进行洗涤剂计数器筛选检测，在含有2.59毫升反应缓冲液的15毫升管中加入300微升的氧化铝和25微升的酶溶液。
轻轻反转管两次，混合反应库存溶液，并在20毫升的反应缓冲液中加入两个Triton X-100洗涤剂的微升。然后，将含有 0.01% Triton X-100 洗涤剂的反应缓冲液加入 2.59 毫升的反应缓冲液，加入新的 15 毫升锥形管中。然后加入300微升的氧化铝和25微升的酶溶液到管中。
轻轻反转管两次，混合反应库存溶液。然后，确定100微摩尔和50微摩尔试验化合物的百分比抑制率，正如刚刚证明的。使用不带洗涤剂的反应库存溶液，用于一组四管和反应库存溶液与洗涤剂一对四管。
为了进行跳跃稀释，将468微升的反应缓冲液和60微升的氧化铝转移到含有53.8微升反应缓冲液、5微升酶溶液和1.2微升的DMSO的管中，这些微升已经孵育了30分钟。以缓慢但深思熟虑的方式吸气和分配混合物两次。在将468微升反应缓冲液和60微升的氧化铝转移到含有53.8微升反应缓冲液的管中之前，将5微升酶溶液和1.2微升的试验化合物孵育30分钟。
如所证明，将第二反应混合两次。并立即将588微升溶液从跳波稀释DMSO控制管转移到含有12微升基板的管中进行混合。继续将 588 微升从跳波稀释试验复合管、未稀释的 DMSO 控制管和未稀释的试复合管转移到三个 1.5 毫升管中，每个管包含 12 微升基板，此后每隔 30 秒进行混合。
然后等待30分钟，然后淬火，收集N NMR光谱，并计算每个化合物的百分比抑制率，正如刚才证明的。这里显示了在使用质子 NMR 的初始测试化合物检测中对 AgNH 测试两种化合物的结果。酶反应最易观察到和量化的腺苷单和双核共振的消失分别为8.48和6.09百万分之一。
和腺素单居的外观在百万分之8.33的30分钟控制光谱中观察到。在图中，在使用质子 NMR 的洗涤剂反筛选检测中，对 AgNH 的两种浓度的化合物进行检测的结果如图所示。使用这两个条件，在基板和产品信号的强度中只观察到最小的差异，表明观察到的酶抑制不是化合物聚集的神器。
请注意，经测试的化合物和洗涤剂产生的共振不会干扰基板或产品共振。使用质子 NMR 对 AGNH 进行跳稀释测定的化合物测试结果表明，与 20 微摩尔反应相比，20 微摩尔反应中基底信号的强度降低，表明抑制是可逆的。在每次反应开始和跳跃稀释过程中进行完整的样品混合至关重要。
需要仔细和一致的愿望和点胶。基于 NMR 的测定也可用于测量整个细胞中的酶活性，使用含有悬浮细胞的溶液代替反应缓冲液和酶。我们的抗三氯monal药物发现工作继续依靠这些测定来测量新合成化合物对核氢酶的功效。
即使只使用很少数量，用于淬火反应的盐酸也是危险的，应与适当的个人防护设备一起使用。
