Los ensayos de actividad basados en RMN proporcionan un método eficaz para identificar, evaluar y validar inhibidores para una enzima determinada. Son particularmente adecuados para la detección de fragmentos. Los ensayos de RMN son susceptibles a las concentraciones compuestas más altas requeridas para los inhibidores más débiles.
Además, la falta de enzimas reporteras las hace menos propensas a falsos positivos. Utilizamos los ensayos de RMN en nuestro laboratorio para identificar y caracterizar los inhibidores de dos enzimas de Trichomonas vaginalis. Ambas enzimas representan nuevos objetivos para nuevos fármacos antireleccomonales.
Los ensayos de RMN son generalmente aplicables a cualquier área de investigación que involucre enzimas, e incluso se pueden utilizar para estudiar las enzimas dentro de las células. Los aspectos más importantes de la técnica son asegurar que los volúmenes de reactivos correctos se pipetean y los componentes de reacción se mezclan a fondo. Para preparar el sustrato y los compuestos de ensayo, añada 12 microlitros de sustrato a cada uno de los cuatro tubos de microfug entre 1,5 mililitros y añada seis microlitros de DMSO deuterado al control de cero minutos y a los tubos de control de 30 minutos.
Agregue seis microlitros del compuesto de ensayo al primer tubo experimental y tres microlitros del compuesto de ensayo y tres microlitros de DMSO deuterado al segundo tubo experimental. A continuación, añada 300 microlitros de óxido de deuterio a un tubo de 15 mililitros que contenga 2,59 mililitros de tampón de reacción, seguido de 25 microlitros de solución enzimática. Invierta suavemente el tubo dos veces para mezclar la solución de material de reacción y agregue 10 microlitros de ácido clorhídrico 1,5 molar a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 582 microlitros de solución de material de reacción.
A continuación, transfiera todo el volumen de solución de material de reacción y ácido al tubo de control de minuto cero para iniciar y apagar simultáneamente la reacción de control de cero minutos. Aspirar y dispensar la muestra dos veces de forma lenta pero deliberada. Inicie y ejecute las tres reacciones restantes de manera escalonada, transfiriendo inmediatamente 582 microlitros de la solución de material de reacción al primer tubo experimental y mezclando la muestra dos veces como se acaba de demostrar.
Una aspiración y dosificación cuidadosas aseguran una mezcla completa durante los pasos de iniciación. Sea coherente con cada muestra para garantizar que la mezcla diferencial no sea una variable. Después de 30 segundos, transfiera 582 microlitros de solución de material de reacción al segundo tubo experimental y mezcle, seguido de la adición de otros 582 microlitros de solución de stock de reacción al tubo de control de 30 minutos 30 segundos después de iniciar la reacción en el segundo tubo experimental.
Después de 30 minutos, añadir 10 microlitros de ácido clorhídrico de 1,5 molar al primer tubo experimental, repitiendo el temple a intervalos de 30 segundos para los segundos tubos de control experimentales y de 30 minutos. Cuando todas las reacciones hayan sido apagadas, transfiera 600 microlitros de solución de cada reacción a tubos de RMN. Para calcular el porcentaje de conversión del sustrato para los espectros de control, cargue las muestras en el espectrómetro, recopile los espectros de RMN y superponga los espectros para los controles de cero y 30 minutos.
Escale la señal de sustrato en el control de minuto cero para que coincida con el control de 30 minutos y observe este porcentaje. A continuación, calcule la conversión porcentual como 100 menos el porcentaje de la coincidencia de las señales de sustrato. Para calcular el porcentaje de conversión del sustrato para las reacciones que contienen el compuesto de prueba, superponga los espectros para el control de minuto cero y la primera reacción que contiene el compuesto de prueba de 500 micromolares y escale la señal de sustrato en el control de minuto cero para que coincida con el espectro con el compuesto de prueba.
Tenga en cuenta este porcentaje y utilícelo para calcular la conversión de porcentaje como se acaba de demostrar. A continuación, superponga los espectros para el control de minuto cero y la primera reacción que contiene el compuesto de prueba de 250 micromolares, y escale la señal de sustrato en el control de minuto cero para que coincida con el espectro con el compuesto de prueba. Después de tener en cuenta el porcentaje, utilícelo para calcular la conversión de porcentaje.
Para calcular la reacción porcentual y la inhibición porcentual para cada concentración compuesta de prueba, primero, calcule la reacción porcentual como la conversión porcentual del compuesto de prueba, dividido por la conversión porcentual de los tiempos de control 100. A continuación, calcule el porcentaje de inhibición como 100 menos la reacción porcentual. Para realizar un ensayo de pantalla de contador de detergente, añada 300 microlitros de óxido de deuterio y 25 microlitros de solución enzimática a un tubo de 15 mililitros que contenga 2,59 mililitros de tampón de reacción.
Invierta suavemente el tubo dos veces para mezclar la solución de material de reacción y agregue dos microlitros de detergente Triton X-100 a 20 mililitros de tampón de reacción. A continuación, añada 2,59 mililitros de tampón de reacción, que contengan un 0,01%De detergente Tritón X-100 a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue 300 microlitros de óxido de deuterio y 25 microlitros de solución enzimática al tubo.
Invierta suavemente el tubo dos veces para mezclar la solución de material de reacción. Entonces, determinar el porcentaje de inhibición para los compuestos de prueba de 100 micromolares y 50 micromolares como se acaba de demostrar. Utilizar la solución de material de reacción sin detergente, para un conjunto de cuatro tubos y la solución de material de reacción con detergente para un segundo juego de cuatro tubos.
Para realizar una dilución de salto, transfiera 468 microlitros de tampón de reacción y 60 microlitros de óxido de deuterio a un tubo que contenga 53,8 microlitros de tampón de reacción, cinco microlitros de solución enzimática y 1,2 microlitros de DMSO que ha estado incubando durante 30 minutos. Aspirar y dispensar la mezcla dos veces de forma lenta, pero deliberada. Antes de transferir 468 microlitros de tampón de reacción y 60 microlitros de óxido de deuterio a un tubo que contiene 53,8 microlitros de tampón de reacción, cinco microlitros de solución enzimática y 1,2 microlitros de compuesto de ensayo que ha estado incubando durante 30 minutos.
Mezclar la segunda reacción dos veces como se ha demostrado. Y transfiera inmediatamente 588 microlitros de solución desde el tubo de control DMSO de salto-dilución a un tubo que contenga 12 microlitros de sustrato con mezcla. Continúe transfiriendo 588 microlitros desde el tubo compuesto de ensayo de salto-dilución, el tubo de control DMSO sin diluir y el tubo compuesto de ensayo sin diluir a cada uno de los tres tubos de 1,5 mililitros, que contienen 12 microlitros de sustrato por tubo con mezcla a intervalos de 30 segundos a partir de entonces.
A continuación, espere 30 minutos antes de apagar las reacciones, recoger los espectros de RMN, y calcular el porcentaje de inhibición para cada compuesto como acaba de demostrar. Aquí se muestran los resultados para probar dos compuestos contra AgNH en un ensayo compuesto de prueba inicial utilizando RMN de protones como se ha demostrado. La reacción enzimática se observa y cuantifica más fácilmente por la desaparición de las resonancias de singlete y doblete de adenosina a 8,48 y 6,09 partes por millón, respectivamente.
Y la aparición de una residencia unifamiliar adenina a 8,33 partes por millón como se observa en el espectro de control de 30 minutos. En esta figura, se muestran los resultados para probar un compuesto en dos concentraciones contra AgNH en un ensayo de contrapantalla detergente utilizando la RMN de protones como se ha demostrado. Sólo se observan diferencias mínimas en las intensidades del sustrato y las señales del producto utilizando las dos condiciones, lo que indica que la inhibición de la enzima observada no es un artefacto de agregación compuesta.
Tenga en cuenta que las resonancias derivadas del compuesto probado y el detergente no interfieren con el sustrato o las resonancias del producto. Los resultados para probar un compuesto en un ensayo de salto-dilución contra AGNH utilizando la RMN de protones como se ha demostrado revelan una intensidad reducida de la señal de sustrato en la reacción de 20 micromolares en comparación con la reacción de 200 micromolares, lo que indica que la inhibición es reversible. Una mezcla de muestra completa durante el inicio de cada reacción y para las diluciones de salto es fundamental.
Se requiere una aspiración y dispensación cuidadosa y consistente. Los ensayos basados en RMN también se pueden utilizar para medir la actividad enzimática en células enteras, utilizando una solución que contiene células suspendidas en lugar del tampón de reacción y la enzima. Nuestros esfuerzos de descubrimiento de fármacos anti-tricomonales continúan confiando en estos ensayos para medir la potencia de los compuestos recién sintetizados contra las enzimas ribohidrinasa.
A pesar de que se utiliza en cantidades muy pequeñas, el ácido clorhídrico utilizado para apagar las reacciones es peligroso y debe utilizarse con el equipo de protección personal adecuado.
