NMR-basierte Aktivitätstests bieten eine effektive Methode zur Identifizierung, Bewertung und Validierung von Inhibitoren für ein bestimmtes Enzym. Sie eignen sich besonders gut für das Fragmentscreening. NMR-Assays sind für die höheren Zusammengesetzten Konzentrationen geeignet, die für schwächere Inhibitoren erforderlich sind.
Darüber hinaus macht der Mangel an Reporterenzymen sie weniger anfällig für falsche Positive. Wir verwenden die NMR-Assays in unserem Labor, um die Inhibitoren von zwei Enzymen aus Trichomonas vaginalis zu identifizieren und zu charakterisieren. Beide Enzyme stellen neue Ziele für neuartige Anti-Trichomonal-Medikamente dar.
Die NMR-Assays sind allgemein auf jeden Forschungsbereich anwendbar, der Enzyme umfasst, und sie können sogar verwendet werden, um die Enzyme in Zellen zu untersuchen. Die wichtigsten Aspekte der Technik sind, sicherzustellen, dass die richtigen Reagenzvolumina pipetiert und die Reaktionskomponenten gründlich gemischt werden. Zur Vorbereitung des Substrats und der Prüfverbindungen fügen Sie jeweils 12 Mikroliter Substrat zu vier 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Rohren hinzu und fügen sechs Mikroliter deuterated DMSO in die Null-Minuten-Steuerung und 30-Minuten-Steuerröhrchen.
Fügen Sie dem ersten Versuchsröhrchen sechs Mikroliter der Testverbindung und dem zweiten Versuchsröhrchen drei Mikroliter der Testverbindung und drei Mikroliter deuterated DMSO hinzu. Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Deuteriumoxid in eine 15-Milliliter-Röhre mit 2,59 Milliliter Reaktionspuffer, gefolgt von 25 Mikroliter Enzymlösung. Um die Reaktionsstofflösung vorsichtig zweimal umzukehren und 10 Mikroliter 1,5 Molsalzsäure in ein 1,5-Milliliter-Rohr mit 582 Mikroliter Reaktionsstofflösung zu geben.
Übertragen Sie dann das gesamte Volumen der Reaktionsstofflösung und Säure in das Null-Minuten-Steuerrohr, um gleichzeitig die Null-Minuten-Kontrollreaktion zu initiieren und zu löschen. Die Probe zweimal langsam, aber absichtlich anzuzapfen und zu dosieren. Initiieren und führen Sie die restlichen drei Reaktionen gestaffelt aus, indem Sie sofort 582 Mikroliter der Reaktionsstocklösung auf das erste Versuchsrohr übertragen und die Probe wie soeben gezeigt zwei Mal mischen.
Eine sorgfältige Aspiration und Dosierung sorgt für eine vollständige Vermischung während der Initiationsschritte. Seien Sie mit jeder Probe konsistent, um sicherzustellen, dass die Differenzmischung keine Variable ist. Übertragen Sie nach 30 Sekunden 582 Mikroliter Reaktionsstocklösung in die zweite Versuchsröhre und -mischung, gefolgt von der Zugabe weiterer 582 Mikroliter Reaktionsstocklösung in das 30-Minuten-Steuerrohr 30 Sekunden nach Beginn der Reaktion im zweiten Versuchsrohr.
Nach 30 Minuten 10 Mikroliter 1,5-Mol-Salzsäure in das erste Versuchsrohr geben und die Abschreckung in 30-Sekunden-Intervallen für die zweite Versuchs- und 30-Minuten-Kontrollröhre wiederholen. Wenn alle Reaktionen abgeschreckt sind, übertragen Sie 600 Mikroliter Lösung aus jeder Reaktion auf NMR-Röhren. Um die prozentuale Umwandlung des Substrats für die Kontrollspektren zu berechnen, laden Sie die Proben auf das Spektrometer, sammeln Sie die NMR-Spektren und überlagern Sie die Spektren für die Null- und 30-Minuten-Steuerung.
Skalieren Sie das Substratsignal in der Null-Minuten-Steuerung, um dem 30-Minuten-Steuerelement zu entsprechen, und notieren Sie diesen Prozentsatz. Berechnen Sie dann die prozentuale Umwandlung als 100 minus den Prozentsatz aus dem Abgleich der Substratsignale. Um die prozentuale Umwandlung des Substrats für die Reaktionen zu berechnen, die die Testverbindung enthalten, überlagern Sie die Spektren für die Null-Minuten-Steuerung und die erste Reaktion, die die 500-Mikromolar-Testverbindung enthält, und skalieren Sie das Substratsignal in der Null-Minuten-Steuerung, um das Spektrum mit der Testverbindung abzugleichen.
Notieren Sie sich diesen Prozentsatz, und verwenden Sie ihn, um die prozentuale Umrechnung zu berechnen, wie gerade gezeigt. Überlagern Sie dann die Spektren für die Null-Minuten-Steuerung und die erste Reaktion, die die 250-Mikromolar-Testverbindung enthält, und skalieren Sie das Substratsignal in der Null-Minuten-Steuerung, um das Spektrum mit der Testverbindung abzugleichen. Nachdem Sie den Prozentsatz notiert haben, verwenden Sie ihn, um die Prozentuale Konvertierung zu berechnen.
Um die prozentuale Reaktion und die prozentuale Hemmung für jede Testverbindungskonzentration zu berechnen, berechnen Sie zunächst die prozentuale Reaktion als prozentuale Umwandlung der Testverbindung, dividiert durch die prozentuale Umwandlung der Regelzeiten 100. Berechnen Sie dann die prozentuale Hemmung als 100 minus die prozentuale Reaktion. Um einen Waschmittelzähler-Bildschirmtest durchzuführen, fügen Sie 300 Mikroliter Deuteriumoxid und 25 Mikroliter Enzymlösung in eine 15-Milliliter-Röhre mit 2,59 Milliliter Reaktionspuffer.
Um die Reaktionsstofflösung vorsichtig umzudrehen, um die Reaktionsstocklösung zu mischen, und fügen Sie zwei Mikroliter Triton X-100 Waschmittel zu 20 Milliliter Reaktionspuffer hinzu. Fügen Sie dann 2,59 Milliliter Reaktionspuffer, der 0,01%Triton X-100 Waschmittel enthält, zu einem neuen 15-Milliliter-Konikonrohr hinzu. Dann fügen Sie 300 Mikroliter Deuteriumoxid und 25 Mikroliter Enzymlösung in die Röhre.
Um die Röhre zwei Mal sanft umzukehren, um die Reaktionsstocklösung zu mischen. Bestimmen Sie dann die prozentuale Hemmung der 100-Mikromolaren- und 50-Mikromolar-Testverbindungen, wie soeben nachgewiesen. Verwendung der Reaktionsstofflösung ohne Waschmittel, für einen Satz von vier Röhren und die Reaktionsstofflösung mit Waschmittel für einen zweiten Satz von vier Röhren.
Um eine Sprungverdünnung durchzuführen, übertragen Sie 468 Mikroliter Reaktionspuffer und 60 Mikroliter Deuteriumoxid in ein Rohr mit 53,8 Mikroliter Reaktionspuffer, fünf Mikroliter Enzymlösung und 1,2 Mikroliter DMSO, das seit 30 Minuten inkubiert wird. Die Mischung zwei Mal langsam, aber absichtlich ansaugen und abgeben. Vor der Übertragung von 468 Mikroliter Reaktionspuffer und 60 Mikroliter Deuteriumoxid in ein Rohr mit 53,8 Mikroliter Reaktionspuffer, fünf Mikroliter Enzymlösung und 1,2 Mikroliter Testverbindung, die seit 30 Minuten inkubiert wird.
Mischen Sie die zweite Reaktion zwei Mal, wie gezeigt. Und sofort 588 Mikroliter Lösung aus dem Sprungverdünnungs-DMSO-Steuerrohr auf ein Rohr mit 12 Mikroliter Substrat mit Mischen übertragen. Weiter transferieren 588 Mikroliter aus dem Jump-Dilution-Testverbundrohr, dem unverdünnten DMSO-Steuerrohr und dem unverdünnten Reagenzglas auf jeweils drei 1,5-Milliliter-Röhren, die 12 Mikroliter Substrat pro Tube enthalten und anschließend in 30-Sekunden-Intervallen mischen.
Warten Sie dann 30 Minuten, bevor Sie die Reaktionen löschen, die NMR-Spektren sammeln und die prozentuale Hemmung für jede Verbindung berechnen, wie gerade gezeigt. Hier werden die Ergebnisse für die Prüfung von zwei Verbindungen gegen AgNH in einem ersten Test-Compound-Assay mit Proton NMR gezeigt, wie gezeigt. Die Enzymreaktion wird am leichtesten beobachtet und quantifiziert durch das Verschwinden der Adenosin-Singlet- und Doublet-Resonanzen bei 8,48 bzw. 6,09 Teilen pro Million.
Und das Auftreten einer adeninen Singlet-Residenz bei 8,33 Teilen pro Million, wie im 30-Minuten-Kontrollspektrum beobachtet. In dieser Abbildung werden die Ergebnisse für die Prüfung einer Verbindung in zwei Konzentrationen gegen AgNH in einem Waschmittel-Gegensieb-Assay mit Proton NMR, wie gezeigt, gezeigt. Nur minimale Unterschiede werden in den Intensitäten des Substrats und der Produktsignale unter Verwendung der beiden Bedingungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Enzymhemmung kein Artefakt der zusammengesetzten Aggregation ist.
Beachten Sie, dass Resonanzen, die aus der getesteten Verbindung und dem Reinigungsmittel entstehen, das Substrat oder die Produktresonanzen nicht stören. Die gezeigten Ergebnisse für die Prüfung einer Verbindung in einem Jump-Dilution-Assay gegen AGNH mit Proton NMR zeigen eine reduzierte Intensität des Substratsignals in der 20-Mikromolaren-Reaktion im Vergleich zur 200-Mikromolaren-Reaktion, was darauf hindeutet, dass die Hemmung reversibel ist. Eine vollständige Probenmischung während der Einleitung jeder Reaktion und für die Sprungverdünnungen ist entscheidend.
Eine sorgfältige und konsistente Aspiration und Abgabe ist erforderlich. NMR-basierte Assays können auch verwendet werden, um die Enzymaktivität in ganzen Zellen zu messen, mit einer Lösung, die suspendierte Zellen anstelle des Reaktionspuffers und enzyms enthält. Unsere Anti-Trichomonal-Medikamente-Entdeckungsbemühungen verlassen sich weiterhin auf diese Assays, um die Wirksamkeit neu synthetisierter Verbindungen gegen die Ribohydrolase-Enzyme zu messen.
Obwohl es nur in sehr geringen Mengen verwendet wird, ist die Salzsäure, die zum Abschrecken der Reaktionen verwendet wird, gefährlich und sollte mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung verwendet werden.
