Os ensaios de atividade baseados em NMR fornecem um método eficaz para identificar, avaliar e validar inibidores para uma determinada enzima. Eles são particularmente adequados para a triagem de fragmentos. Os ensaios de RN são favoráveis às concentrações compostas mais elevadas necessárias para inibidores mais fracos.
Além disso, a falta de enzimas de repórteres as torna menos propensas a falsos positivos. Usamos os ensaios de RMN em nosso laboratório para identificar e caracterizar os inibidores de duas enzimas de Trichomonas vaginalis. Ambas as enzimas representam novos alvos para novas drogas anti-tricolmonais.
Os ensaios de RN são geralmente aplicáveis a qualquer área de pesquisa que envolva enzimas, e eles podem até mesmo ser usados para estudar as enzimas dentro das células. Os aspectos mais importantes da técnica são garantir que os volumes corretos de reagente sejam pipetos e os componentes de reação sejam completamente misturados. Para preparar os compostos de substrato e teste, adicione 12 microlitadores de substrato a cada um dos quatro tubos de microfuge de 1,5 mililitro e adicione seis microliters de DMSO deuterados ao controle de zero-minuto e tubos de controle de 30 minutos.
Adicione seis microliters do composto de teste ao primeiro tubo experimental e três microliters do composto de teste e três microliters de DMSO deuterados ao segundo tubo experimental. Em seguida, adicione 300 microliters de óxido de deutério a um tubo de 15 mililitros contendo 2,59 mililitros de tampão de reação, seguido por 25 microliters de solução enzimática. Inverta suavemente o tubo duas vezes para misturar a solução de estoque de reação e adicione 10 microliters de ácido clorídrico molar de 1,5 milaturro a um tubo de 1,5 mililitro contendo 582 microliters de solução de estoque de reação.
Em seguida, transfira todo o volume de solução de estoque de reação e ácido para o tubo de controle de zero-minuto para iniciar simultaneamente e saciar a reação de controle de zero minuto. Aspirar e dispensar a amostra duas vezes de forma lenta, mas deliberada. Inicie e execute as três reações restantes de forma escalonada, transferindo imediatamente 582 microliters da solução de estoque de reação para o primeiro tubo experimental e misturando a amostra duas vezes como apenas demonstrado.
Uma aspiração cuidadosa e dispensação garante uma mistura completa durante as etapas de iniciação. Seja consistente com cada amostra para garantir que a mistura diferencial não seja uma variável. Após 30 segundos, transfira 582 microliters de solução de estoque de reação para o segundo tubo experimental e mix, seguido pela adição de outros 582 microliters de solução de estoque de reação para o tubo de controle de 30 minutos 30 segundos após iniciar a reação no segundo tubo experimental.
Após 30 minutos, adicione 10 microlitadores de ácido clorídrico de 1,5 molar ao primeiro tubo experimental, repetindo a saciedação em intervalos de 30 segundos para os tubos de controle experimentais e de 30 minutos. Quando todas as reações tiverem sido suprimidas, transfira 600 microliters de solução de cada reação para tubos NMR. Para calcular a conversão percentual de substrato para o espectro de controle, carregue as amostras no espectrômetro, colete o espectro NMR e sobreponha os espectros para os controles zero e 30 minutos.
Dimensione o sinal do substrato no controle de zero minutos para corresponder ao controle de 30 minutos e observe essa porcentagem. Em seguida, calcule a conversão percentual como 100 menos a porcentagem da correspondência dos sinais do substrato. Para calcular a conversão percentual do substrato para as reações contendo o composto de teste, sobreponha o espectro para o controle de zero-minuto e a primeira reação contendo o composto de teste de 500 micromolares e dimensione o sinal do substrato no controle de zero minuto para combinar o espectro com o composto de teste.
Observe esta porcentagem e use-a para calcular a conversão percentual como apenas demonstrado. Em seguida, sobreponha o espectro para o controle de zero-minuto e a primeira reação contendo o composto de teste de 250 micromolar, e dimensione o sinal do substrato no controle de zero-minuto para combinar o espectro com o composto de teste. Depois de notar a porcentagem, use-a para calcular a conversão percentual.
Para calcular a reação percentual e a inibição percentual para cada concentração composta de teste, primeiro, calcule a reação percentual como a conversão percentual do composto de teste, dividida pela conversão percentual do controle vezes 100. Então calcule a inibição percentual como 100 menos a reação por cento. Para realizar um ensaio de tela de contador de detergente, adicione 300 microliters de óxido de deutério e 25 microliters de solução enzimática a um tubo de 15 mililitros contendo 2,59 mililitros de tampão de reação.
Inverta suavemente o tubo duas vezes para misturar a solução de estoque de reação, e adicione dois microliters de detergente Triton X-100 a 20 mililitros de tampão de reação. Em seguida, adicione 2,59 mililitros de tampão de reação, contendo detergente Triton X-100 de 0,01% a um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 300 microliters de óxido de deutério e 25 microliters de solução enzimápica ao tubo.
Inverta suavemente o tubo duas vezes para misturar a solução de estoque de reação. Então, determine a inibição percentual para os compostos de teste de 100 micromolares e 50 micromolares como apenas demonstrado. Utilizando a solução de estoque de reação sem detergente, para um conjunto de quatro tubos e a solução de estoque de reação com detergente para um segundo conjunto de quatro tubos.
Para realizar uma diluição de salto, transfira 468 microliters de tampão de reação e 60 microliters de óxido de deutério para um tubo contendo 53,8 microliters de tampão de reação, cinco microliters de solução enzimática e 1,2 microliters de DMSO que vem incubando por 30 minutos. Aspire e dispense a mistura duas vezes de forma lenta, mas deliberada. Antes de transferir 468 microliters de tampão de reação e 60 microliters de óxido de deutério para um tubo contendo 53,8 microliters de tampão de reação, cinco microliters de solução enzimática e 1,2 microliters de composto de teste que vem incubando por 30 minutos.
Misture a segunda reação duas vezes como demonstrado. E transfira imediatamente 588 microliters de solução do tubo de controle DMSO de diluição de salto para um tubo contendo 12 microlitadores de substrato com mistura. Continue transferindo 588 microliters do tubo composto de teste de diluição de salto, o tubo de controle DMSO não diluído, e o tubo composto de ensaio não diluído para cada um dos três tubos de 1,5 mililitros, contendo 12 microliters de substrato por tubo com mistura em intervalos de 30 segundos posteriormente.
Em seguida, aguarde 30 minutos antes de saciar as reações, coletando o espectro de RMN e calculando a inibição percentual para cada composto como apenas demonstrado. Aqui os resultados para testar dois compostos contra AgNH em um ensaio composto de teste inicial usando NMR de prótons como demonstrado são mostrados. A reação enzimática é mais facilmente observada e quantificada pelo desaparecimento das ressonâncias singlet e doublet em 8,48 e 6,09 partes por milhão, respectivamente.
E o aparecimento de uma residência adenina singlet a 8,33 partes por milhão, como observado no espectro de controle de 30 minutos. Nesta figura, os resultados para testar um composto em duas concentrações contra AgNH em um ensaio de contra-tela de detergente usando nMR de prótons como demonstrado são mostrados. Apenas diferenças mínimas são observadas nas intensidades do substrato e dos sinais do produto utilizando as duas condições, indicando que a inibição da enzima observada não é um artefato de agregação composta.
Observe que as ressonâncias decorrentes do composto testado e do detergente não interferem nas ressonâncias do substrato ou do produto. Os resultados para testar um composto em um ensaio de diluição de salto contra a AGNH usando nMR de prótons como demonstrado revelam uma intensidade reduzida do sinal de substrato na reação de 20 micromolar em comparação com a reação de 200 micromolares, indicando que a inibição é reversível. Uma mistura completa de amostras durante o início de cada reação e para as diluições de salto é fundamental.
É necessária uma aspiração e dispensação cuidadosa e consistente. Ensaios baseados em NMR também podem ser usados para medir a atividade enzimática em células inteiras, usando uma solução contendo células suspensas no lugar do tampão de reação e enzima. Nossos esforços de descoberta de drogas anti-trichomonais continuam a depender desses ensaios para medir a potência dos compostos recém-sintetizados contra as enzimas ribohidrolase.
Embora seja usado em quantidades apenas muito pequenas, o ácido clorídrico usado para saciar as reações é perigoso e deve ser usado com o equipamento de proteção individual adequado.
