这种方法可以帮助回答人类疟疾寄生虫P.Falciparum生物学中的关键问题，通过条件性敲除帮助发现蛋白质功能。与以前的方法相比，该技术的主要优点是，它允许相对容易地生成条件突变体。首先，转到"斩波"并选择 Fasta Target'下目标，粘贴来自基因开放读取帧三个黄金端的 200 个碱基对，以及从基因的三个主要 UTR 开始的 200 个碱基对粘贴。

在"选择 P.Falciparum"和选择 CRISPR/Cas9'下一步下，单击"查找目标站点"从显示的选项中选择 gRNA 序列，优先选择最接近修改站点且离目标站点最近的最高效的 gRNA。购买 gRNA 序列及其反向补品作为聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡糖。用于定位PfH-sp70x的gRNA序列可以在文本协议中找到。

将 pMK-U6、pUF1-Cas9 和 pHA-glmS DNA 各加入 40 微克，加入无菌 1.5 毫米离心管。将水中三摩尔醋酸钠的DNA体积的十分之一加入到管子中，然后用涡流混合。然后，将100%乙醇的体积的2.5倍添加到管子中，使用涡流混合至少30秒。

将管子放在冰上或在零下20摄氏度下放置30分钟。然后，在18，300次G下将管离心，在4摄氏度下30分钟。离心后，小心地从管中去除上经液，而不会干扰颗粒。

将70%乙醇的体积加三倍到管子中，然后用涡流短暂混合。在 4 摄氏度下将管在 18，300 次 G 下离心 30 分钟。再次，小心地从管中去除上一液，而不干扰颗粒。

使管保持打开状态，让颗粒风干 15 分钟。将沉淀的DNA储存在零下20摄氏度，直到转染需要。要转染 RBC，请准备 1X 细胞混合缓冲区以及文本协议中描述的不完整和完整的 RPMI。

使用 0.22 微米过滤器对缓冲液进行灭菌。将 380 微升的 1X 细胞混合添加到 DNA 和涡流中溶解。让DNA溶解在1X细胞混合中10分钟，每三分钟旋转10秒。

在无菌的15毫升锥形管中，将300微升的分离人类RBC与4毫升1X细胞混合相结合。将 RBC 以 870 倍 G 离心三分钟。然后从 RBC 颗粒中去除上因。

用DNA-细胞混合混合物重新悬浮RBC颗粒，并转移到0.2厘米电穿孔的细胞中。使用文本协议中列出的条件对 RBC 进行波分。电穿孔后，将内维从圆锥体转移到含有5毫升完整RPMI的15毫升圆锥管中。

在20摄氏度下以870倍G离心管，3分钟。然后，将上一点液去。现在，将颗粒重新悬浮在四毫升完整的RPMI中，并转移到六井组织培养板中的一个井中。

在传输的 RBC 中加入 400 个高氧化氮培养物的微升，在 3% 的氧气、3% 的 CO2 和 94% 的氮气下保持所有培养物的温度。第二天，用四毫升完整的RPMI洗涤培养。

将培养在 870 倍 G 下离心三分钟。吸上一道。在四毫升完整的 RPMI 中重新挂起培养。

48 小时后，用四毫升完整的 RPMI 洗涤培养。然后，在包含一个微摩尔 DSM1 的完整 RPMI 中重新挂起培养基，以选择 Cas9 质粒。在此点之后，将培养基替换为新鲜完整的 RPMI，每 48 小时更换一个微摩尔 DSM1。

每天继续用完整的RPMI清洗培养物，直到血液涂片不再可见寄生虫。为了进行血液涂片，移液器150微升培养成0.6毫升的离心管。在1，700次G下进行离心造粒后，吸走上经剂。

使用移液器将颗粒细胞转移到玻璃滑梯上。使用第二个玻璃幻灯片以 45 度角保持到第一个幻灯片，涂抹血滴。根据制造商的协议，使用市售的染色套件对幻灯片进行染色。

使用 100 次油浸目标查看寄生虫。从转染后五天开始，在培养媒介中重新悬浮 RBC 时，去除两毫升培养的培养。以2%的血红蛋白加入两毫升的新鲜介质和血液。

以这种方式每周添加一次新鲜血液，直到寄生虫再次出现，由瘦血涂片决定。对寄生虫培养物进行连续稀释，以达到每200微升0.5个寄生虫的最终浓度。在 96 孔组织培养板的井中加入 200 微升稀释培养剂。

保持克隆板，直到在井中检测到寄生虫。每48小时更换96井板中的介质，用新鲜介质。每周一次，从开始克隆板开始的五天后开始，从每一个井中去除100微升，并添加100微升的新鲜介质加血液。

要识别任何含有寄生虫的井，请将 96 孔板以 45 度角放置约 20 分钟，使血液在板内以一定角度沉淀。然后，将 96 井板放在灯箱上。请注意，含有寄生虫的井中含有黄色的介质，与无寄生虫井的粉红色介质相比，由于寄生虫对介质的酸化。

使用血清移液器，将含有寄生虫的井的内容移动到24孔组织培养板，以允许寄生虫的膨胀。使用 PCR 分析，检查这些克隆寄生虫线是否正确整合。此处显示了免疫荧光测定的结果，证明了PfH-sp70x的HA标记成功。

PfH-sp70x glmS 寄生虫被固定并染色，并染色为核标记物，以及 HA 抗体。膜相关组蛋白丰富的蛋白质一，蛋白质出口到宿主RBC的标记。此处显示了使用葡萄糖胺治疗后 PfH-sp70x 蛋白质水平的西式 Blot 分析。如预期的那样，在治疗期间蛋白质水平会降低。

这项技术为寄生虫生物学领域的研究人员研究寄生虫生物学中的基本问题铺平了道路。重要的是要记住，P.Falciparum是一种血液传播的病原体，在进行此程序时应佩戴适当的个人防护设备。