我们有标准化的样品制备方案，用于成像彩龟胚胎，硬蛋壳和真菌培养使用扫描电子显微镜。这些综合方法使用对已知协议的细微改变来处理三个微妙的组织，从而可以区分原始结构和处理伪影。与我展示这个程序的将是杰西卡·吉本斯，一个来自我实验室的研究生。
在筑巢季节从田间地场采集海龟蛋之前，请沿塑料盒两侧和盖子上打四到六个 0.25 厘米的孔，以便进行呼吸。在将湿润的紫土和泥炭苔床上用品混合物以一比一的比例填充包装盒之前。在筑巢地点，轻轻清除土壤，以发现鸡蛋，用稀释的碘药擦拭每个海龟蛋的表面，以防止孵化过程中微生物污染。
将每个盒子最多放置 8 到 9 个鸡蛋，在放置时的方向和对齐方式相同，使单个离合器彼此分离。所有卵子收集后，手动将卵子的一半埋在床上用品中，将盖盒放在30摄氏度的孵化器中10至17天，分别获得胚胎期12、13和18个胚胎。每隔一天加入蒸馏水，将床上用品部分湿润，以避免脱水，并保持正常胚胎发育的水分水平。
在适当的开发阶段，用尖剪刀将一侧切成后壳和蛋黄膜，垂直到鸡蛋的长轴上。接下来，沿着短轴切割卵子的另一侧，用钳子将切除的切开，将胚胎侧向上剥开。切切蛋壳的另一侧，将切除的壳放入PBS中。
使用立体显微镜和钳子，从蛋壳中剥离胚胎和蛋黄膜。使用钳子和微型剪刀去除额外的胚胎膜，并使用胚胎勺将胚胎移植到新鲜PBS的培养皿中。洗去任何血液和蛋黄后，在12井板中每井最多放置3个胚胎，在4摄氏度下含有4%的甲醛，为期两到三天。
当样品显示为白色时，使用聚苯乙烯插入物和聚酯网底冲洗胚胎，每次洗涤用三次五分钟洗净新鲜 PBS。上次洗涤后，在上升乙醇系列中脱水样品，每次浓度一小时。第二次乙醇浸入后，将胚胎干燥在一系列 HMDS 中，以乙醇浓度进行 20 分钟，每次浸入 Petri 盘部分覆盖。
然后将胚胎放在最终的 100%HMDS 溶液中，在一夜之间完全或部分覆盖在烟罩中。通过逐渐增加HDMS对乙醇的浓度来减缓干燥对于揭示胚胎中良好的表面结构非常重要。第二天早上，使用双斗碳导电胶带小心地将完全干燥的样品安装在标准铝销根上。
安装所有样品后，将样品引入溅射涂布机室，在 35 毫安溅射下用非常薄的金膜涂覆 60 到 120 秒。然后牢固地固定固定螺钉，将存根安装到相应的浇注板上。使用样品交换工具将样品架传输到扫描电子显微镜的样品室中进行成像。
要准备蛋壳进行电子显微镜扫描，请将蛋壳放在蒸馏水中至少一小时后，胚胎收获，以消除任何蛋黄或白素污染。接下来，在烟罩中，用细腻的防静电湿巾将清洁的蛋壳风干一夜。将干燥的蛋壳存放在干净的试样瓶中，按数量和胚胎阶段标记。
然后，安装，溅出涂层和图像的蛋壳标本，刚刚证明为胚胎。要建立幻灯片真菌培养物，请使用无菌手术刀切割半到三英寸的固体土豆葡萄糖糖块，并将其块放在单独的玻璃显微镜幻灯片上。将无菌牙签放在干净的 Petri 盘的底部，用于将滑轨从它们上抬起，在板和滑梯之间形成表面张力。
将每张幻灯片放在培养皿中的牙签上。接下来，使用无菌循环将真菌从标本中分转移到阿加块的四个侧侧。在幻灯片周围的培养皿中加入几滴无菌蒸馏水，以确保生长的真菌的水分。
用石蜡膜部分密封板，将板放在30摄氏度的培养箱中，为真菌物种提供适当的孵化期。在孵化结束时，从培养皿上取下滑梯，使用无菌钳子将紧粘附的粘附的阿加块从幻灯片转移到3%谷胱甘肽的容器中，在4摄氏度下进行过夜孵化。第二天早上，在上升乙醇系列中脱水样品，每浓度15分钟。
90% 浸入后，在将脱水样品放入临界点干燥装置的腔室之前，用两个 30 分钟的变化对 100% 乙醇进行最后脱水处理，以确保完全饱和。密封腔室并打开阀门，让液态二氧化碳排出，让乙醇排出，直到液体二氧化碳完全填满腔室。接下来，密封并缓慢加热腔室，以达到临界点，当腔室压力超过1000磅压力每平方英寸，温度超过31摄氏度，和二氧化碳的液体和气体空间处于平衡状态。
然后慢慢将二氧化碳从腔室和样品中排出为气体，以避免表面张力对样品产生任何影响，并安装、板和图像真菌标本，如所示。对第12阶段彩龟胚胎的横向扫描电子显微图视图揭示了最大突出是如何超越月状的，并在医疗上限制一个标记良好的鼻坑。五个咽拱也可以观察到。
在阶段15胚胎中，新形成的胚胎在胚胎的后尾区域可见，前肢胚芽比呼吸机更明显。甲壳体脊的一个明确定义的外生也可以沿着胚胎的整个间侧翼区域进行可视化。在阶段 18， 一个短的倾斜的倾斜鼻子已经形成与稍微向上的下嘴与终端钩， 适合上嘴的中心缺口.
上颚呈现出切开的外观，可以看到一个小蛋牙在上颚尖形成。通过扫描电子显微镜对 Chrysemys 皮塔蛋壳和壳膜进行超结构分析，揭示了一个外层钙化物蛋壳层，牢固地附着在内丝壳膜上。蛋壳的外表面由由球状球形结核组成的著名矿化壳体组成，它们排列成群状，在相邻壳体之间排列，浓度为小圆凹陷或不同大小的孔隙。
通用方法不能推广所有生物标本，以实现体面的图像质量使用SEM。 独特的改变，如证明是一个特定的组织类型是必不可少的。化学和空气干燥方法也可用于其他有机样品，耦合滑动培养技术可用于所有柔软、坚固的微生物培养。
