Abbiamo protocolli standardizzati di preparazione dei campioni per l'imaging di embrioni di tartarughe dipinte, gusci d'uovo rigidi e colture fungine utilizzando la microscopia elettronica a scansione. Questi metodi completi utilizzano sottili alterazioni dei protocolli noti per elaborare tre tessuti delicati che consentono la differenziazione tra strutture originali e l'elaborazione degli artefatti. A dimostrare la procedura con me sarà Jessica Gibbons, una studentessa laureata del mio laboratorio.
Prima di raccogliere le uova di tartaruga da un sito di campo durante la stagione di nidificazione, fai da quattro a sei fori da 0,25 centimetri lungo i lati delle scatole di plastica e sui loro coperchi per consentire l'aerazione. Prima di riempire le scatole con una miscela umida di vermiculite e torba muschio biancheria da letto miscela ad un rapporto uno a uno. Nel sito di nidificazione, rimuovere delicatamente il terreno per scoprire le uova e pulire la superficie di ogni uovo di tartaruga con una tintura diluita di iodio per proteggere dalla contaminazione microbica durante l'incubazione.
Posizionare un massimo di otto-nove uova per scatola nello stesso orientamento e allineamento in cui sono state deposte, mantenendo le singole frizioni separate l'una dall'altra. Una volta raccolte tutte le uova, seppellire manualmente le uova a metà nella biancheria da letto e posizionare le scatole lidded all'interno di un'incubatrice Celsius di 30 gradi per 10-17 giorni per ottenere rispettivamente stadi embrionali 12, 13 e 18 embrioni. Aggiungere acqua distillata per bagnare parzialmente il mezzo di lettiera a giorni diversi per evitare la disidratazione e mantenere il livello di umidità per il normale sviluppo dell'embrione.
Nella fase appropriata di sviluppo, utilizzare forbici appuntite per fare un taglio su un lato del guscio d'uovo dorsale e della membrana del tuorlo insieme, verticalmente al lungo asse dell'uovo. Quindi, tagliare l'altro lato dell'uovo lungo l'asse corto e utilizzare le forcelle per sbucciare il pezzo asportato con il lato embrionale verso l'alto. Tagliare l'altro lato laterale del guscio d'uovo e posizionare il pezzo di guscio asportato in PBS.
Utilizzando uno stereomicroscopio e forceps, sbucciare l'embrione e la membrana del tuorlo dal guscio d'uovo. Utilizzare le forcep e le micro forbici per rimuovere le membrane embrionali extra e utilizzare un cucchiaio embrionale per trasferire l'embrione in una piastra di Petri di PBS fresco. Dopo aver lavato via sangue e tuorlo, posizionare fino a tre embrioni per pozzo di una piastra da 12 po ', contenente il 4% di paraformaldeide a quattro gradi Celsius per due o tre giorni.
Quando i campioni appaiono bianchi, utilizzare inserti in polistirolo con fondo in rete di poliestere per risciacquare gli embrioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare i campioni in una serie crescente di etanolo per un'ora per concentrazione. Dopo la seconda immersione in etanolo, asciugare gli embrioni in una serie di concentrazioni da HMDS a etanolo per 20 minuti per immersione con le piastre di Petri parzialmente coperte.
Quindi mettere gli embrioni in un'ultima soluzione 100%HMDS, completamente o parzialmente coperta in una cappa aspirante durante la notte. L'essiccazione lenta aumentando gradualmente la concentrazione di HDMS in etanolo è importante per rivelare un'eccellente struttura superficiale negli embrioni. La mattina successiva, utilizzare nastro conduttivo in carbonio a doppio bastoncino per montare con cura i campioni completamente essiccati su uno stub standard in alluminio.
Una volta montati tutti i campioni, introdurre i campioni nella camera del rivestimento dello sputter per rivestire i campioni con una pellicola d'oro molto sottile per 60-120 secondi a uno sputter da 35 milliamp. Quindi fissare saldamente le viti impostate per montare gli stub sulle corrispondenti piastre di versamento. Utilizzare lo strumento di scambio del campione per trasferire il portacampioni nella camera campione del microscopio elettronico a scansione per l'imaging.
Per preparare i gusci d'uovo per la microscopia elettronica a scansione, posizionare i gusci d'uovo in acqua distillata per almeno un'ora dopo il raccolto dell'embrione per eliminare qualsiasi contaminazione da tuorlo o albumina. Successivamente, asciugare all'aria i gusci d'uovo puliti su delicate salviette antistabiliche nel cappuccio dei fumi durante la notte. Conservare i gusci d'uovo essiccati in bottiglie di campioni puliti, etichettati per numero e stadio embrionale.
Quindi, montare, sputter cappotto e immagine gli esemplari guscio d'uovo come appena dimostrato per gli embrioni. Per stabilire colture fungine di scorrimento, utilizzare un bisturi sterile per tagliare da metà a tre quarti di pollice di agar di destrosio di patate solide e posizionare i blocchi sui singoli vetrini del microscopio di vetro. Posizionare gli stuzzicadenti sterili sul fondo delle piastre di Petri pulite per sollevare gli scivoli da esse per creare tensione superficiale tra la piastra e lo scivolo.
Posizionare ogni diapositiva sugli stuzzicadenti nella piastra di Petri. Successivamente, utilizzare un anello sterile per trasferire funghi dall'inoculo del campione a ciascuno dei quattro lati laterali di un blocco di agar. Aggiungere alcune gocce di acqua distillata sterile alla piastra di Petri intorno allo scivolo per garantire l'umidità per i funghi in crescita.
Sigillare parzialmente la piastra con pellicola di paraffina e posizionare la piastra nell'incubatrice di 30 gradi Celsius per il periodo di incubazione appropriato per le specie fungine. Alla fine dell'incubazione, rimuovere lo scivolo dalla piastra di Petri e utilizzare forcep sterili per trasferire il blocco di agar strettamente aderenti dallo scivolo a un contenitore di glutaraldeide al 3% per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, disidratare i campioni in una serie crescente di etanolo per 15 minuti per concentrazione.
Dopo l'immersione al 90%, elaborare i campioni per la disidratazione finale con due variazioni di 30 minuti in etanolo al 100% per garantire una saturazione completa prima di posizionare i campioni disidratati nella camera dell'apparato critico di essiccazione a punti. Sigillare la camera e aprire le valvole per consentire all'anidride carbonica liquida di sfogarsi e lasciare sfogare l'etanolo fino a quando l'anidride carbonica liquida non riempie completamente la camera. Quindi, sigillare e riscaldare lentamente la camera per ottenere un punto critico quando la pressione della camera supera i 1.000 libbre di pressione per pollice quadrato, la temperatura supera i 31 gradi Celsius e lo spazio liquido e gassoso dell'anidride carbonica è in equilibrio.
Quindi drenare lentamente l'anidride carbonica dalla camera e dal campione come gas, per evitare qualsiasi effetto della tensione superficiale sul campione e montare, placcare e immaginire i campioni fungini come dimostrato. Una visione della micrografia elettronica a scansione laterale di un embrione di tartaruga dipinta allo stadio 12 rivela come la prominenza mascellare si estenda oltre il limite mandibolare e medialmente una fossa nasale ben marcata. Si possono anche osservare cinque archi faringei.
In un embrione di fase 15, i somiti appena formati sono visibili nella regione posteriore della coda dell'embrione e le gemme dell'articolo anteriore puntano più cortamente che ventralmente. Una crescita ben definita di una cresta carapace può anche essere visualizzato lungo l'intera regione del fianco interlimb dell'embrione. Allo stadio 18, si è formato un muso corto e debolmente proiettante con un becco inferiore leggermente rovesciato con un gancio terminale che si inserisce nella tacca centrale del becco superiore.
La mascella superiore mostra un aspetto dentellato e si può vedere un piccolo dente d'uovo che si forma sulla punta della mascella superiore. L'analisi ultrastrutturale del guscio d'uovo chrysemys picta e della membrana del guscio mediante microscopia elettronica a scansione, rivela uno strato esterno di guscio d'uovo calcarinus, saldamente attaccato alla membrana interna del guscio filamentoso. La superficie esterna del guscio d'uovo è costituita da ben distinte unità di guscio mineralizzato fatte di noduli sferici globulari disposti in gruppi e tra unità di guscio adiacenti, con una concentrazione di piccole depressioni arrotondate o pori di varie dimensioni.
Le metodologie comuni non possono essere generalizzate per tutti i campioni biologici per ottenere una qualità dell'immagine decente utilizzando SEM. Le alterazioni uniche come dimostrato sono essenziali per uno specifico tipo di tessuto. Il metodo di essiccazione chimica e ad aria potrebbe essere utilizzato anche per altri campioni organici e la tecnica di coltura dello scivolo di accoppiamento potrebbe essere utilizzata per tutte le colture microbiche morbide e robuste.
