斑马鱼光学杯形态形成的四维成像

我们对眼形态形成的理解来自以前的固定组织研究。然而，这些研究缺乏细胞和组织动力学。使用延时成像，我们能够捕获整个过程进行可视化和分析。

我们的方法，利用斑马鱼胚胎的光学清晰度的外部发展，促进活成像，并使用激光扫描共聚焦显微镜，这是在大多数研究校园很容易获得。新采用这种方法的研究人员在获取可用数据集之前，应该会进行一些试验和错误。许多步骤，特别是注射和嵌入，必须顺利进行，才能成功，所以要有耐心。

一旦斑马鱼开始繁殖，同时等待15至20分钟，以确保卵子成为受精，使用P10移液器和P10微升尖端背负拉玻璃毛细管微注射针与2.5至5微升的RNA稀释的兴趣。当卵子准备好时，使用转移移液器和解剖显微镜小心地将卵子装入注射模具中，使用钳子滚动胚胎，使单个细胞在必要时可见。然后在单细胞阶段注射所有胚胎，瞄准细胞而不是蛋黄，以确保发育中的胚胎有一个统一的标签。

施肥后约11小时，在42摄氏度的热阻隙中，将E3介质中1.6%低熔化糖的1至5毫升的藻类放在中间，并使用荧光显微镜筛选成功注射的具有整体荧光亮度的胚胎。数一数，使胚胎正常分期。施肥后11小时，应观察到三个闷闷不乐。

理想的样品将具有强大的EGFP和mCherry信号，并处于正确的发展阶段。安装前，将胚胎放入一个涂有琼脂的盘子中，并用钳子从每个胚胎中取出胆汁。当所有的胚胎都被否认时，用玻璃滚筒移液器吸气一个胚胎。

弹出尽可能多的E3，使胚胎坐在玻璃巴斯德移液器的尖端，并下降胚胎到从热块的气管。让胚胎沉入气管几秒钟，然后与胚胎一起吸气少量的阿加罗斯，小心胚胎保持在移液器的尖端。将胚胎和藻子喷射到玻璃底盘中的玫瑰滴中，并快速但小心地使用钳子在玫瑰滴硬化之前将胚胎的侧面向下定向。

以同样的方式安装 10 到 12 个胚胎后，加入足够的阿加罗斯，以完全覆盖包裹在单个玫瑰盘中所有液滴的盘子底部。当藻糖变硬时，在阿加罗斯上层 E3 以保持样品水分。将激光扫描聚焦显微镜设置到适当的延时成像参数后，将玻璃底盘的底面涂上浸入介质，与水的折射度指数相匹配，注意避免气泡，并将一小滴浸入介质涂抹到 40 倍水目标上。

固定舞台插入的玻璃底盘，并添加额外的E3介质，以保持胚胎在一夜之间湿润。使用建模粘土将塑料盖密封在盘子上，并提高与菜肴接触的目标。在显微镜软件的标题下，单击添加以保存第一个样品的 XYZ 信息，以便延时，并选择具有强荧光和最佳安装的示例。

在定位选项卡下，搜索下一个示例并单击位置并添加以选择所示示的示例。当所有示例都已选中时，突出显示第一个位置并单击移动到。在持续扫描时，将光学囊泡排列在框架内，相对于光学囊泡和大脑，在前部和相交区域留出充足的空间。

要分配第一个和最后一个 Z 切片，请选择设置第一和设置最后，同时通过 Z 方向与精细的焦点旋钮移动，保持总切片数量约 63，以适应光学杯的生长。包括光学囊泡的腹腔侧的额外空间，以留出生长空间。设置第一个和最后一个 Z 切片后，单击 C 以移动到 Z 堆栈的中心，并调整激光功率并获取两种激光。

设置激光功率和增益后，停止扫描并单击更新以更新位置信息。要移动到下一个位置，请单击位置二。一旦第一个和最后一个 Z 切片被定义为演示，打开时间系列标题并将周期数设置为 300，时间间隔设置为 2.5 分钟。

在查看设置以确保所有内容都完成后，单击开始延时并确认第一轮成像捕获正确，然后才允许延时运行一夜。直接注射到单个细胞是统一标签和强力荧光的必要条件。当胚胎沉浸于高糖中时，胚胎应在整个盘子中均匀地间隔。

如果胚胎的分期正确、荧光充足且安装充分，它们将在延时期间保持在成像框架中，从而能够对整个器官进行成像。不沿正点轴方向的样本（如水平或对角线的样本）会随着延时而从成像框架中长出，无法用于进一步分析。过度旋转的胚胎会导致更后延。

旋转不足的胚胎只能观察到最前组织。此外，安装在框架方向上的样品更有可能产生成功的延时。这种对腹腔侧的偏向为腹腔方向的组织生长提供了额外的空间，从而产生最佳的延时。

当不符合这些标准时，延时将不再捕获组织发展的整个 3D 体积，无法用于进一步分析。这些信息丰富的数据集可以通过多种方式进行分析，包括具有细胞速度和轨迹量化的 4D 细胞跟踪、细胞和组织体积测量以及 3 和 4D 可视化。