小鼠胚胎中早期心脏祖细胞的实时成像

该协议允许在小鼠胚胎发育时对其进行成像。这样可以详细研究早期心脏发生。与拍摄假胚胎的静态图像一样，实时成像可以完全访问研究胚胎发育中的动态过程。

生命成像所需的技能很难从仅文本出版中掌握。看着另一个人这样做对于学习至关重要。首先，切割一厘米长的钨丝片，并通过将钨丝尖端浸入饱和硝酸钠溶液中，将它们磨尖至直径0.02至0.05毫米。

要准备弯头玻璃毛细管，请将标准一毫米玻璃毛细管的中点放在本生打火机上三到六秒钟，从两端缓慢拉动，直到毛细管变薄且有弹性。然后，将毛细管分成两半并短暂加热，以产生距尖端两厘米的 90 度弯曲。锯了一块长约7毫米、宽约4毫米、厚2毫米的聚甲基丙烯酸甲酯。

使用台虎钳固定甲基丙烯酸酯片，然后在整个件上横向钻定制孔。缓慢旋转钻头，同时施加低但恒定的压力。使用精细锉刀平滑支架边缘并调整其大小。

此外，在支架的边缘创建一个温和的斜坡，以促进胚胎定位。将完成的支架放入装有蒸馏水的盘子中冲洗。在体视显微镜下，检查支架以查看孔中是否含有钻孔粉尘。

如果有灰尘，请使用钨针将其清除。要对支架进行消毒，请将其放入装满蒸馏水的锥形管中，并以至少 20 瓦的功率输出进行超声处理 20 分钟。从安乐死的胚胎日6.75至7.5怀孕小鼠中提取子宫，并将其放在干燥干净的纸巾上。

然后，切开子宫，从中小侧插入细剪刀的尖端，然后沿着刀片滑动以露出蜕膜，并将它们转移到解剖介质中。解剖胚胎，保持胎外锥完好无损。然后，剥开Reichter的膜，将其一部分留在额外的胚胎区域。

为保持解剖介质温暖，请每 10 分钟更换一次。此外，以三到四个人为一组解剖落叶，同时将其余部分保存在放置在 37 摄氏度浴中的解剖介质中。立即将解剖的胚胎放入培养基中。

使用荧光体视显微镜选择具有所需荧光特征的胚胎，并将它们放入细胞培养箱中含有培养基的管中，在成像前恢复两个小时。打开所有显微镜组件（包括计算机、软件和激光器）后，打开二氧化碳控制器并将其设置为 7%将一滴高真空硅脂滴在带有玻璃盖滑底的 35 毫米培养皿上。将支架放在液滴顶部，轻轻按压使其固定。

对于胚胎安装，将两到三个胚胎从培养箱转移到带有支架的培养皿中。使用一对镊子和一根锥形钨针，将胚胎放在孔中。用针头通过胎盘外锥钩住胚胎，并将其插入大小匹配的孔中。

小心地将装有胚胎和支架的培养皿移动到显微镜板上。降低物镜，直到在中等物镜界面形成液体弯月面。将胚胎置于焦点上后，安装培养室并使用胶带将其密封在物镜周围。

使用显微镜控制软件的实时捕获，调整激光输出和增益水平。然后，将石蜡油缓慢滴在物镜上，用石蜡油覆盖培养基。设置延时摄影录制。

设置一个 5 到 10 分钟的间隔，堆叠之间有 3 到 5 微米的 Z 间距。在Z-Stack顶部留出空白区域以预测胚胎生长。至少 50 微米，每小时增加 30 微米，采集将不受监督。

启用自动保存选项以允许从计算机监控采集，以便在需要时调整Z-Stack大小，以适应焦点内的感兴趣区域。显示了通过多光子成像的活体全身胚胎心脏发育。在胚胎第7.5天，整个神经外胚层存在静脉荧光，内脏和胚胎中胚层处有一些阳性细胞核。

四小时后，内皮祖细胞激活静脉并组装形成心内膜管和下层主动脉，七小时后成为封闭结构。去除Reichter的膜时要小心。它可以真正粘在胚胎上，尤其是在预振荡阶段。

在移除过程中，尝试通过额外的胚胎区域捏住膜。