走査型電子顕微鏡を用いて、カメの胚、硬質卵殻、真菌培養物をイメージングするためのサンプル調製プロトコルを標準化しています。これらの包括的な方法は、既知のプロトコルへの微妙な変更を使用して、3つの繊細な組織を処理し、元の構造とアーティファクトの処理を可能にします。私と一緒に手順を実証することは、私の研究室の大学院生ジェシカ・ギボンズです。
巣の季節にフィールドサイトからカメの卵を収集する前に、プラスチックボックスの側面に沿って、そして彼らの蓋に4〜6つの0.25センチメートルの穴を作り、気を出るようにします。バーミチュライトと泥炭苔の寝具の混合物の湿った混合物を1対1の比率で箱に充填する前に。巣の場所で、卵を明らかにするために土壌を静かに取り除き、各カメの卵の表面を希釈したヨウ素チンキで拭き取り、インキュベーション中の微生物汚染から保護します。
1箱あたり最大8~9個の卵を、産んだのと同じ方向とアライメントに置き、個々のクラッチを互いに分離します。すべての卵が採取されたら、手動で卵を半分の寝具に埋め、蓋付き箱を30°Cインキュベーター内に10〜17日間置き、それぞれ胚性の段階12、13、18個の胚を得る。脱水を避けるために、一日おきに寝具媒体を部分的に濡らし、正常な胚発生のための水分レベルを維持するために蒸留水を加えます。
開発の適切な段階で、尖ったはさみを使用して、卵の長い軸に垂直な、一緒に後部卵殻と黄身膜の片側にカットを行います。次に、短い軸に沿って卵の反対側を切断し、鉗子を使用して、胚側を上に切除した切除片を剥離する。卵殻のもう一方の側側を切り、切除した殻をPBSに入れます。
実体顕微鏡と鉗子を用いて、卵殻から胚と黄身の膜を剥がす。鉗子とマイクロハサミを使用して余分な胚膜を取り除き、胚スプーンを使用して胚を新鮮なPBSのペトリ皿に移します。血液と黄身を洗い流した後、12ウェルプレートのウェルあたり最大3つの胚を置き、摂氏4度で4%パラホルムアルデヒドを2〜3日間含む。
サンプルが白く見える場合は、ポリエステルメッシュボトム付きのポリスチレンインサートを使用して、洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の5分間の洗浄で胚を洗い流します。最後の洗浄後、上昇エタノール系列で1濃度で1時間脱水します。2番目のエタノール浸漬後、一連のHMDSで胚を乾燥させて、部分的に覆われたペトリ皿で浸漬ごとに20分間エタノール濃度を行う。
その後、胚を最後の100%HMDS溶液に入れ、一晩ヒュームフードで完全または部分的に覆う。エタノールに対するHDMSの濃度を徐々に増加させることによる遅い乾燥は、胚における優れた表面構造を明らかにするために重要である。翌朝、ダブルスティックカーボン導電テープを使用して、完全に乾燥したサンプルを標準的なアルミニウムピンスタブに慎重に取り付けます。
すべてのサンプルが取り付けられているとき、35ミリアンペアスパッタで60〜120秒間金の非常に薄いフィルムで標本をコーティングするためにスパッタコーターチャンバーにサンプルを導入します。次に、セットねじをしっかりと固定して、対応する注ぎプレートにスタブを取り付けます。サンプル交換ツールを使用して、サンプルホルダーを走査型電子顕微鏡のサンプルチャンバーに移してイメージングします。
走査型電子顕微鏡用の卵殻を準備するには、卵殻を胚の収穫後少なくとも1時間蒸留水に入れて、卵黄またはアルブミン汚染を除去する。次に、空気は一晩煙のフードで繊細な静電気防止ワイプで洗浄された卵殻を乾燥させます。乾燥した卵殻を清潔な標本ボトルに保管し、数と胚の段階でラベル付けします。
その後、取り付け、スパッタコート、胚のためにちょうど実証したように卵殻標本を画像化します。滑り物の真菌培養を確立するには、無菌メスを使用して、固体ジャガイモデキストロース寒天の半分から4分の3インチのブロックをカットし、個々のガラス顕微鏡スライドにブロックを置きます。きれいなペトリ皿の底に滅菌爪楊枝を置き、プレートとスライドの間に表面張力を作り出すためにスライドを上げます。
ペトリ皿のつまようじに各スライドを置きます。次に、滅菌ループを使用して、試料接種から寒天ブロックの4つの側面のそれぞれに真菌を移す。成長する真菌の水分を確保するために、スライドの周りのペトリ皿に滅菌蒸留水の数滴を追加します。
パラフィンフィルムでプレートを部分的に密封し、真菌種に適したインキュベーション期間のために30°Cインキュベーターにプレートを置きます。インキュベーションの最後に、ペトリ皿からスライドを取り出し、滅菌鉗子を使用して、しっかりと接着した寒天ブロックをスライドから3%グルタルアルデヒドの容器に移し、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、サンプルを上昇エタノール系列で15分間脱水する。
90%浸漬後、100%エタノールに2つの30分の変化を伴う最終脱水用サンプルを処理し、脱水サンプルを臨界点乾燥装置のチャンバーに入れる前に完全な飽和を確保する。チャンバーを密封し、バルブを開けて液体二酸化炭素を通気させ、液体二酸化炭素がチャンバーを完全に満たすまでエタノールを通気させます。次に、チャンバー圧が1平方インチ当たり1,000ポンドの圧力を超え、温度が摂氏31度を超え、二酸化炭素の液体および気体空間が平衡状態にあるときに、チャンバを密閉し、臨界点を達成するためにチャンバをゆっくりと加熱する。
次に、チャンバーと試料からガスとして二酸化炭素をゆっくりと排出し、試料に対する表面張力の影響を避け、試験的に真菌標本を取り付け、プレート、および画像化する。ステージ12に塗られたカメの胚の横方向走査電子顕微鏡写真図は、上顎の目立ちが下顎管を越えてどのように広がり、内側がよくマークされた鼻穴を制限するかを明らかにする。5つの咽頭のアーチも観察することができる。
ステージ15胚では、新たに形成されたスマイトは胚の後尾部領域で見ることができ、前肢の芽は腹側よりも皮質的に指す。カラパス尾根の明確に定義された成長は、胚の四肢間側面領域全体に沿って視覚化することもできる。ステージ18では、上部くちばしの中央ノッチに収まる端子フックを備えた少し上向きの下のくちばしで短い突出したスナクが形成されました。
上顎はノッチの外観を示し、上顎の先端に小さな卵歯が形成されているのが見えます。走査型電子顕微鏡によるクリセミスピクタ卵殻及びシェル膜の超構造解析は、内糸状殻膜にしっかりと付着した外カルカリヌス卵殻層を明らかにする。卵殻の外面は、様々なサイズの小さな丸みを帯びたくぼみまたは細孔の濃度を有するグループおよび隣接するシェル単位の間に配置された球状の球状の小結節で作られたよく区別されたミネラル化されたシェル単位から成っている。
一般的な方法論は、SEMを使用してまともな画質を達成するためにすべての生物学的標本のために一般化することはできません。化学および空気乾燥法は、他の有機サンプルにも使用することができ、カップリングスライド培養技術は、すべての柔らかく、堅牢な微生物培養に使用することができます。
