우리는 스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 그려진 거북이 배아, 단단한 계란 껍질 및 곰팡이 배양을 이미징하기위한 샘플 준비 프로토콜을 표준화했습니다. 이러한 포괄적인 방법은 알려진 프로토콜에 대한 미묘한 변경을 사용하여 원래 구조와 아티팩트 처리 사이의 분화를 허용하는 세 가지 섬세한 조직을 처리합니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 제시카 기븐스, 내 실험실에서 대학원생이 될 것입니다.
둥지 시즌 동안 필드 사이트에서 거북이 알을 수집하기 전에 플라스틱 상자의 측면을 따라 4 ~ 6 0.25 센티미터 구멍을 만들고 뚜껑에 식기를 허용하십시오. 버미쿨라이트와 토탄 이끼 침구 혼합물을 1 대 1 비율로 촉촉하게 혼합하여 상자를 채우기 전에. 둥지 부위에서는 토양을 부드럽게 제거하여 알을 발견하고 각 거북이 알의 표면을 희석된 요오드 팅크로 닦아 인큐베이션 중 미생물 오염으로부터 보호합니다.
상자당 최대 8~9개의 알을 배치한 것과 동일한 방향과 정렬에 배치하여 개별 클러치를 서로 분리합니다. 모든 계란이 수집되면 침구에 계란 반을 수동으로 묻고 10~17일 동안 30도 의 섭씨 인큐베이터 안에 뚜껑을 두어 배아 단계 12, 13 및 18 개의 배아를 얻습니다. 탈수를 방지하고 정상적인 배아 발달을 위해 수분 수준을 유지하기 위해 매일 침구 매체를 부분적으로 적시고 증류수를 첨가합니다.
적절한 개발 단계에서 뾰족한 가위를 사용하여 등쪽 달걀 껍질과 노른자 막의 한쪽에 잘라 내어 달걀의 긴 축으로 수직으로 자른다. 다음으로, 짧은 축을 따라 계란의 반대편을 자르고, 집게를 사용하여 배아 쪽을 위로 열어 껍질을 벗깁니다. 달걀 껍질의 다른 측면을 잘라 PBS에 껍질의 절제 된 조각을 배치합니다.
스테레오현미경과 집게를 사용하여 달걀 껍질에서 배아와 노른자 막을 껍질을 벗깁니다. 집게와 마이크로 가위를 사용하여 여분의 배아 막을 제거하고 배아 숟가락을 사용하여 배아를 신선한 PBS의 페트리 접시로 옮킵니다. 혈액과 노른자를 씻은 후, 12웰 플레이트당 최대 3개의 배아를 두어 2~3일 동안 섭씨 4도에 파라포름알데히드를 함유합니다.
샘플이 흰색으로 나타나면 폴리에스테르 메쉬 하의가 있는 폴리스티렌 인서트를 사용하여 세척당 신선한 PBS에서 35분 세척으로 배아를 헹구십시오. 마지막 세척 후, 농도 당 1 시간 동안 상승 에탄올 시리즈에서 탈수 샘플. 두 번째 에탄올 침수 후, 부분적으로 덮여 페트리 접시와 침지 당 20 분 동안 에탄올 농도에 HMDS의 시리즈에서 배아를 건조.
그런 다음 마지막 100% HMDS 용액에 배아를 배치하여 밤새 연기 후드로 완전히 또는 부분적으로 덮입니다. HDMS의 농도를 에탄올로 점진적으로 증가시킴으로써 건조를 늦추는 것은 배아내 우수한 표면 구조를 드러내는 데 중요하다. 다음 날 아침, 이중 스틱 탄소 전도성 테이프를 사용하여 완전히 건조된 샘플을 표준 알루미늄 핀 스텁에 조심스럽게 장착하십시오.
모든 시료가 장착된 경우, 샘플을 스퍼터 코팅 챔버에 도입하여 35mm 스퍼터에서 60~120초 동안 매우 얇은 금필름으로 시편을 코팅합니다. 그런 다음 세트 나사를 단단히 고정하여 해당 붓는 접시에 스텁을 장착합니다. 샘플 교환 도구를 사용하여 이미징을 위해 샘플 홀더를 스캐닝 전자 현미경의 샘플 챔버로 전송합니다.
전자 현미경 검사용 달걀 껍질을 준비하기 위해 배아 수확 후 적어도 1 시간 동안 증류수에 달걀 껍질을 놓아 노른자 또는 알부민 오염을 제거하십시오. 다음으로, 공기는 밤새 연기 후드에 섬세한 정전기 방지 물티슈에 청소 된 달걀 껍질을 건조. 말린 달걀 껍질을 깨끗한 표본 병에 보관하고 숫자와 배아 단계로 표시합니다.
그런 다음, 배아에 대해 입증된 바와 같이 달걀 껍질 표본을 마운트, 스퍼터 코트 및 이미지화합니다. 슬라이드 곰팡이 문화를 확립하려면 멸균 메스를 사용하여 고체 감자 덱스트로스 천의 절반에서 3 분기 인치 블록을 자르고 개별 유리 현미경 슬라이드에 블록을 놓습니다. 깨끗한 페트리 접시 바닥에 멸균 이쑤시개를 놓아 슬라이드를 들어 올려 플레이트와 슬라이드 사이의 표면 장력을 만듭니다.
페트리 접시에 각 슬라이드를 이쑤시개위에 놓습니다. 다음으로, 멸균 루프를 사용하여 시편 접종에서 한천 블록의 4개의 측면으로 곰팡이를 전달합니다. 슬라이드 주변의 페트리 접시에 멸균 증류수 몇 방울을 추가하여 성장하는 곰팡이의 수분을 보장합니다.
부분적으로 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 곰팡이 종에 대한 적절한 잠복기 30도 에 접시를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 페트리 접시에서 슬라이드를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 단단히 부착된 한천 블록을 슬라이드에서 3%의 글루타랄데히드 용기로 옮겨 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 아침, 농도 당 15 분 동안 오름차순 에탄올 시리즈에서 샘플을 탈수.
90%침수 후, 100%에탄올에서 2개의 30분 변화와 함께 최종 탈수시 샘플을 처리하여 임계점 건조 장치의 챔버에 탈수된 샘플을 배치하기 전에 완전한 채도를 보장한다. 챔버를 밀봉하고 액체 이산화탄소가 배출될 수 있도록 밸브를 열고 액체 이산화탄소가 챔버를 완전히 채울 때까지 에탄올이 배출되도록 합니다. 다음으로, 챔버 압력이 평방 인치 당 1, 000 파운드의 압력을 초과하고 온도가 섭씨 31도를 초과하고 이산화탄소의 액체 및 가스 공간이 평형에있을 때 챔버를 밀봉하고 천천히 가열하여 임계 점을 달성합니다.
그런 다음 챔버와 시료를 가스로 천천히 배출하여 시료에 표면 장력의 영향을 피하고, 입증된 곰팡이 표본을 마운트, 플레이트 및 이미지화한다. 12단계 거북이 배아의 측면 스캐닝 전자 현미경 보기는 상악이 하악을 넘어 어떻게 확장되는지, 그리고 내측으로 잘 표시된 비강 구덩이를 제한하는 방법을 보여줍니다. 5개의 인두 아치도 관찰할 수 있습니다.
단계 15 배아에서, 새로 형성된 소미트는 배아의 후방 꼬리 부위에서 볼 수 있으며, 앞다리 싹은 통풍구보다 더 cortally 포인트. 갑피 능선의 잘 정의된 아웃스컬은 또한 배아의 전체 사지 측면 영역을 따라 시각화될 수 있다. 18단계에서는 부리의 중앙 노치에 맞는 터미널 후크가 있는 약간 뒤집힌 하부 부리를 장착하여 짧은 투영 주부가 형성되었습니다.
위턱은 노치 된 모양을 나타내며, 작은 계란 치아는 위턱의 끝에서 형성되는 것을 볼 수 있습니다. 전자 현미경 검사를 스캔하여 크리세미 피타 달걀 껍질과 조개 막의 초구조적 분석은 내부 필라멘에 단단히 부착 된 외부 칼칼리누스 달걀 껍질 층을 보여줍니다. 달걀 껍질의 외부 표면은 다양한 크기의 작은 둥근 우울증이나 기공의 농도와 함께, 그룹 및 인접한 쉘 단위 사이에 배치 구형 구형 결절로 만든 잘 구별 미네랄 쉘 단위로 구성되어 있습니다.
일반적인 방법론은 SEM을 사용하여 괜찮은 이미지 품질을 달성하기 위해 모든 생물학적 표본에 대해 일반화 될 수 없습니다. 화학 및 공기 건조 방법은 다른 유기 샘플에도 사용될 수 있으며, 커플링 슬라이드 배양 기술은 모든 부드럽고 견고한 미생물 배양에 사용될 수 있습니다.
