对TNBS介导肠纤维化发展的力学洞察与拉帕霉素抑制作用的评价

该协议在人类中表现出克罗恩纤维化高度可比的病理生理学，并讨论了拉帕霉素的抑制作用对肠道纤维化的影响。该协议的主要优点是，它描述了肠道纤维化的发展在很短的时间从四到八周，这给了我们机会来研究组织修复和组织再生。该协议将有助于研究人员谁急于获得纤维化的机制，并帮助找到更好的技术，以预测干预克罗恩相关的肠道纤维化。

要开始此过程，请剃光颈部周围的成年小鼠，以便通过皮肤暴露对 TNBS 进行预敏感。然后用 TNBS 浸泡一个科顿拭子，并将其涂抹在鼠标颈部的剃光区域。敏感后八天，每周一次，六周，通过直肠内治疗诱发结肠炎。

为此，使用100微升灌肠，通过连接到钢磨针的1毫升注射器，在25%乙醇中应用4毫克TNBS。只给对照小鼠100微升25%乙醇。麻醉小鼠后，每天以每公斤两毫克的速度注射雷帕霉素，或两者同时注射，每个工作日为对照组和TNBS治疗小鼠注射三到六周。

在此之后，使用六周TNBS后处理小鼠肠道分析细胞外测定。首先，在冰冷的HSS中纵向打开结肠，在HBSS中清洗结肠。使用无菌剪刀将结肠切成大约五厘米的 HBSS 小片。

将小结肠组织片段转移到含有10毫升消化缓冲液的15毫升锥形管中。在 37 摄氏度的培养箱中以 100 RPM 转速摇动管子 20 分钟。接下来，通过40微米细胞过滤器的悬浮液，并丢弃附着的结肠上皮。

从过滤器中收集剩余的组织，并在含有胶原酶 IV 型和 DNASE1 的消化缓冲液中进一步消化，在 1X HBSSS 中，用 5%FBS 在 37 摄氏度的培养箱中 20 分钟，同时在 100 RPM 下摇动。在此之后，涡流消化的组织约20秒，并通过一个40微米细胞过滤器，以获得层状的正分。在700倍的G和4摄氏度的离心层状，以分解细胞。

然后，制作 100 毫升的 30% 和 70% 密度梯度介质解决方案。将获得的细胞重新用 30% 溶液的 10 毫升中重新发送，并覆盖在 15 毫升管中 70% 溶液的 5 毫升以上。在1000倍G和室温下在无断裂条件下将梯度离心。

收集含有层状淋巴细胞的白环相，该细胞将在30%和70%梯度层之间。将获得的细胞重新在冰冷的HSS中清洗，并在500°C和10摄氏度下离心10分钟。然后在 FACS 缓冲区中重新发送单元格。

在抗体染色之前，首先用抗小鼠CD16在冰上用32FC阻滞剂孵育15分钟，阻断层状细胞的细胞表面。接下来用抗CX3CR1PE抗体和抗PE微珠在冰上孵育细胞30分钟，捕获结合细胞，然后用FACS缓冲液清洗细胞。通过磁场中的磁激活细胞分拣柱传递抗体和珠束细胞，以去除未绑定的细胞。

用 FACS 缓冲液清洗细胞三次。在此之后，从磁场中移除柱，并推柱塞在柱中产生珠束细胞。首先，用32FC块在冰上用抗小鼠CD16阻断拉米纳丙烯细胞。

使用抗CD64、CD11c、CD11b、CX3CR1、Ly6C和MHC II类抗体对细胞进行应变，然后使用FACS流式细胞仪对细胞进行排序，如文本协议中所述。将分类的细胞酶，用于总RNA制备，并检测细胞因子和纤维化标记。从磁纯化中分离的单细胞悬浮液分析纤维化标记物和炎症细胞因子分析的mRNA表达。

要开始细胞表面染色和分析，在15毫升的FACS缓冲液中重新填充50万至100万个分离的拉米纳丙烯细胞。用抗CD16的细胞孵育32个抗体，在冰上稀释1至50，10分钟。在此之后，用500微升的冰冷FACS缓冲液清洗细胞，以去除未绑定的抗体。

表面染色结肠单细胞悬浮液，用荧光标记抗体在冰上稀释1至100分钟30分钟。每次洗涤时，使用 500 微升的冰冷 FACS 缓冲液清洗标记的细胞，以去除未绑定的抗体。然后按文本协议中概述的流动细胞图分析标记的单核细胞。

要开始细胞因子染色和分析，请使用固定渗透溶液套件，根据制造商的说明固定和渗透表面染色的细胞。如文本协议中所述的切中层状丙体细胞，以检测IL-1β细胞因子的细胞内水平。接下来，通过添加 FACS 缓冲液和在 200 倍 G 和 4 摄氏度的离心 5 分钟来清洗细胞，以去除多余的固定缓冲液。

重复一次此洗涤。要确定α平滑肌肉作用水平，首先用固定渗透溶液套件渗透细胞。用抗αSMA亚历克萨氟488抗体在冰上稀释1至1000分钟，孵育细胞。

然后通过添加 FACS 缓冲液和在 200 倍 G 和 4 摄氏度的离心 5 分钟来清洗细胞，以去除多余的固定缓冲液。重复一次此洗涤。执行 FACS 分析并像文本协议中概述的单元格进行门控。

本研究采用TNBS结肠炎小鼠模型来研究和阐明肠道纤维化的基本机制。经过六周的 TNBS 治疗后，可以看到，在 TNBS 治疗过程中，结肠长度逐渐缩短，从对照组的约 5 厘米缩短到 TNBS 组的约 3 厘米。为了确保 TNBS 克罗恩病模型与人类克罗恩的纤维化模型具有可比性，并且不是与该方法相关的伪影，在详细的时道研究中对纤维化标记进行了多个级别的分析。

在大多数纤维化发生率中，都报告了α平滑肌活性蛋白阳性细胞和胶原蛋白沉积的积累，并被视为纤维化事件的标志为了比较TNBS纤维化与克罗恩的相关纤维化，在活体CD或缓解不足患者的新鲜组织活检中分析了纤维化标记物和细胞因子的表达。值得注意的是，标记诱导被看到的α平滑肌肉活性正层增厚和增加胶原蛋白沉积在活动CD部分。进行西印点分析，以确认在活性CD样本中诱导α平滑肌肉行为素表达。

此外，通过qPCR分析检测纤维化标记物的显著诱导。然后评估M4活性的药理抑制剂拉帕霉素的作用，以确定限制TNBS纤维化的机制。小鼠同时接受TNBS和拉帕霉素治疗，并分析结肠组织学中α平滑肌肉作用素和胶原蛋白的水平。

重要的是要记住，接种相同数量的TNBS到每只小鼠，并尽快处理分离的米纳丙烯细胞，以避免细胞损失，以及保持细胞活力。我们的协议详细介绍了TNBS纤维化和纤维化缓解，以及纤维化形成中拉帕霉素的抑制因子。其他研究人员可能有兴趣使用这种技术，以找到更好的药物靶点纤维化和结肠癌。

请记住，TNBS 是一种皮肤刺激物，在处理过程中应穿实验室外套，以避免皮肤接触。