Ce protocole présente une pathophysiologie très comparable de la fibrose de Crohn chez l’homme et traite également des effets inhibiteurs de la rapamycine sur la fibrose intestinale. Le principal avantage de ce protocole est qu’il décrit le développement de la fibrose intestinale en très peu de temps variant de quatre à huit semaines, ce qui nous donne la possibilité d’étudier la réparation des tissus et la régénération des tissus. Ce protocole sera utile aux chercheurs qui sont pressés d’obtenir le mécanisme de la fibrose, et aider à trouver une meilleure technologie pour prédire l’intervention pour la fibrose intestinale associée de Crohn.
Pour commencer cette procédure, raser des souris adultes autour de la région du cou afin de les pré-sensibiliser au TNBS par exposition cutanée. Puis tremper un écouvillon de coton avec TNBS et l’appliquer sur la zone rasée du cou de la souris. Huit jours après la sensibilisation, induire une colite par administration intrarectale une fois par semaine, pendant six semaines.
Pour ce faire, appliquer quatre milligrammes de TNBS dans 25% d’éthanol à l’aide d’un lavement de 100 microlitres via une seringue d’un millilitre attachée à une aiguille de gavage en acier. Donnez aux souris témoins 100 microlitres de 25% d’éthanol seulement. Après anesthésier les souris, injecter intraperitoneally soit la rapamycine à deux milligrammes par kilogramme par jour, ou un véhicule, ou les deux, tous les jours de la semaine pendant trois à six semaines à la fois pour le contrôle et les souris traitées par TNBS.
Après cela, utilisez des intestins de souris post-traités TNBS de six semaines pour analyser les analyses extracellulaires. Tout d’abord, ouvrez le côlon longitudicially dans le HBSS froid de glace et lavez le côlon dans HBSS. À l’aide de ciseaux stériles, couper le côlon en petits morceaux d’environ cinq centimètres de HBSS.
Transférer les petits morceaux de tissu du côlon dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de tampon pré-digestion. Secouez le tube à 100 RPM dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, passez la suspension à travers une passoire à cellules de 40 micromètres, et jetez l’épithélium colonique attaché.
Recueillir le tissu restant de la passoire et les digérer davantage dans le tampon de digestion contenant de la collagène de type IV et DNASE1 en 1X HBSS avec 5%FBS pendant 20 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius tout en secouant à 100 RPM. Après cela, vortex les tissus digérés pendant environ 20 secondes et le passer à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres pour obtenir des fractions propria lamina. Centrifugez les fractions de propria lamina à 700 fois G et quatre degrés Celsius pour pelleter les cellules.
Ensuite, faire 100 millilitres de 30% et 70% de densité gradient solutions de médias. Resuspendez les cellules obtenues en 10 millilitres de la solution de 30% et superposez ceci au-dessus de cinq millilitres de la solution de 70% dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez le gradient dans un état de rupture libre à 1000 fois G et température ambiante.
Recueillir la phase de l’anneau blanc contenant les lymphocytes propria lamina, qui sera entre les couches de gradient de 30% à 70%. Lavez les cellules obtenues en les réutilisant dans le HBSS glacé et en les centrifugant à 500 fois G et 10 degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis résuspendez les cellules dans le tampon FACS.
Avant la coloration des anticorps, bloquez d’abord la surface cellulaire des cellules propria lamina en les incubant avec un bloqueur anti-souris CD16 par 32FC sur la glace pendant 15 minutes. Ensuite, incuber les cellules avec des anticorps anti-CX3CR1 PE avec des microbilles anti-PE sur la glace pendant 30 minutes pour capturer les cellules liées, puis laver les cellules avec tampon FACS. Passez les cellules liées aux anticorps et aux perles à travers une colonne magnétique de tri cellulaire activée dans un champ magnétique pour enlever les cellules non liées.
Lavez les cellules trois fois avec le tampon FACS. Après cela, retirez la colonne du champ magnétique et poussez le piston dans la colonne pour donner les cellules liées aux perles. Tout d’abord, bloquer les cellules propria lamina avec anti-souris CD16 par bloqueur 32FC sur la glace.
Filtrer les cellules en couveant avec des anticorps anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C et MHC de classe II Puis trier les cellules à l’aide d’un cytomètre d’écoulement FACS tel que décrit dans le protocole de texte. Lyse les cellules triées pour la préparation totale de l’ARN et de détecter la cytokine et les marqueurs fibrotiques. Analyser l’expression de l’ARNm des marqueurs fibrotiques et l’analyse inflammatoire de cytokine à partir de suspensions isolées à cellules simples de la purification magnétique.
Pour commencer la coloration et l’analyse de la surface cellulaire, resuspendez entre 500 000 et 1 million de cellules de propria lamina isolées dans 15 millilitres de tampon FACS. Incuber les cellules avec des anti-CD16 par 32 anticorps à une dilution de 1 à 50 sur la glace pendant 10 minutes. Après cela, lavez les cellules avec 500 microlitres de tampon FACS froid de glace pour enlever les anticorps non liés.
Les suspensions à cellule unique du côlon de surface avec des anticorps étiquetés fluorescents à une dilution de 1 à 100 sur la glace pendant 30 minutes. Lavez les cellules étiquetées deux fois pour enlever les anticorps non liés à l’aide de 500 microlitres de tampon FACS glacé pour chaque lavage. Ensuite, analyser les cellules mononucléaires étiquetées par cytomètre d’écoulement tel que décrit dans le protocole de texte.
Pour commencer la coloration et l’analyse intracellulaires de cytokine, utilisez un kit de solution de permeabilization de fixation pour fixer et perméabilize les cellules souillées de surface selon les instructions du fabricant. Portez les cellules de propria de lamina comme décrit dans le protocole de texte pour détecter le niveau intracellulaire de cytokine bêta d’IL-1. Ensuite, lavez les cellules en ajoutant le tampon FACS et la centrifugeuse à 200 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer l’excès de tampon fixatif.
Répétez ce lavage une fois. Pour déterminer le niveau alpha lisse d’actine de muscle, d’abord permeabilize cellules avec le kit de solution de permeabilization de fixation. Incuber les cellules avec des anticorps anti-alpha SMA Alexa Fluor 488 à une dilution de 1 à 1000 sur la glace pendant 30 minutes.
Lavez ensuite les cellules en ajoutant un tampon FACS et une centrifugeuse à 200 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer l’excès de tampon fixatif. Répétez ce lavage une fois. Effectuez l’analyse FACS et portez les cellules comme décrit dans le protocole de texte.
Dans cette étude, le modèle de souris colite TNBS est adopté pour étudier et élucider les mécanismes sous-jacents de la fibrose intestinale. Après six semaines de traitement de TNBS, on peut voir que la longueur du côlon s’est raccourcie progressivement au cours du traitement de TNBS d’environ cinq centimètres dans le groupe témoin à environ trois centimètres dans le groupe de TNBS. Pour s’assurer que le modèle de la maladie de TNBS Crohn est comparable au modèle humain de la fibrose de Crohn et n’est pas un artefact lié à la méthodologie, les marqueurs fibrotiques sont analysés à plusieurs niveaux dans une étude détaillée du cours du temps.
L’accumulation des cellules positives alpha lisses d’actine de muscle et du dépôt de collagène dans les couches submucosal ont été rapportées dans la plupart des incidences de fibrose et est considérée comme marque pour des événements fibrotiques pour comparer la fibrose de TNBS avec Crohn' fibrose associée de s, l’expression des marqueurs de fibrose et des cytokines est analysée dans la biopsie de tissu frais de l’iléum des patients présentant le CD actif ou sous la remise. Remarquablement, l’induction marquée est vue de l’épaississement des couches positives alpha lisses d’actine de muscle et du dépôt accru de collagène dans les sections actives de CD. L’analyse occidentale de tache est exécutée pour confirmer l’induction de l’expression lisse d’actine de muscle alpha dans les échantillons actifs de CD.
En outre, l’induction significative des marqueurs de fibrose est détectée par l’analyse de qPCR. Les effets de la rapamycine, un inhibiteur pharmacologique de l’activité M4 sont ensuite évalués pour déterminer un mécanisme pour limiter la fibrose TNBS. Les souris sont traitées avec le TNBS et la rapamycine et les niveaux d’actine musculaire alpha lisse et de collagène dans l’histologie du côlon sont analysés.
Il est important de se rappeler d’inoculer la même quantité de TNBS à chaque souris et de traiter les cellules isolées de propria de lamina dès que possible pour éviter la perte de cellules aussi bien que pour maintenir la viabilité cellulaire. Nos détails de protocole sur la fibrose de TNBS et la remise de la fibrose aussi bien que le facteur inhibiteur de rapamycine dans la formation de fibrose. D’autres chercheurs pourraient être intéressés à utiliser cette technique pour trouver une meilleure cible médicament pour la fibrose et le cancer du côlon.
S’il vous plaît rappelez-vous que TNBS est un irritant pour la peau et les manteaux de laboratoire doivent être portés pendant la manipulation pour éviter tout contact avec la peau.
