このプロトコルは、クローンのヒト線維症の非常に比較可能な病態生理学を示し、また、腸線維症に対するラパマイシン媒介阻害作用について議論する。このプロトコルの主な利点は、腸線維症の発症を4〜8週間の間に非常に短い時間で記述し、組織修復と組織再生を研究する機会を与えてくれる点です。このプロトコルは、線維症のメカニズムを取得するために急いでいる研究者に役立ちます, そしてクローンの関連する腸線維症の介入を予測するためのより良い技術を見つけるのに役立ちます.
この手順を開始するには、真皮暴露を介してTNBSに予感性を与えるために、首の領域の周りに成体マウスを剃る。その後、TNBSでコトン綿棒を浸し、マウスの首の剃った領域に適用します。感作後8日間、週1回、6週間の間、直腸内投与により大腸炎を誘発する。
これを行うには、鋼のガベージ針に取り付けられた1ミリリットルの注射器を介して100マイクロリットルの浣腸を使用して25%エタノールにTNBSの4ミリグラムを適用する。コントロールマウスに25%エタノールの100マイクロリットルを与える。マウスを麻酔した後、腹腔内にラパマイシンを1日当たり2ミリグラムで注入するか、または車両、またはその両方を、毎週平日に3〜6週間、対照およびTNBS処置マウスの両方に注入する。
この後、細胞外アッセイを分析するために6週間のTNBS後処理されたマウス腸を使用する。まず、氷冷HBSSで結腸を縦方向に開き、HBSSで結腸を洗浄する。滅菌はさみを使用して、HBSSで約5センチメートルの小片にコロンをカットします。
小さな結腸組織片を、10ミリリットルの消化前バッファーを含む15ミリリットルの円錐管に移します。37°Cのインキュベーターで100 RPMでチューブを20分間振ります。次に、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して懸濁液を通過させ、付着した大腸上皮を廃棄する。
ストレーナーから残りの組織を収集し、100 RPMで振りながら37°Cのインキュベーターで5%FBSで1X HBSSのコラゲナーゼタイプIV型とDNASE1を含む消化バッファーでさらに消化します。この後、消化した組織を約20秒間渦化させ、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通過して層のプロプリア画を得る。薄層プロプリア分画を700倍Gで、摂氏4度で細胞をペレット状に遠心する。
その後、30%と70%の両方の濃度勾配培地溶液の100ミリリットルを作ります。得られた細胞を30%溶液の10ミリリットルで再懸濁し、これを15ミリリットルチューブ内の70%溶液の5ミリリットルの上に重ね合わせます。Gと室温の1,000倍の破断条件で勾配を遠心分離する。
30%と70%の勾配層の間になる層のプロプリアリンパ球を含む白い環相を収集します。得られた細胞を氷冷HBSSで再懸濁し、500倍Gと摂氏10度で10分間遠心分離して洗浄します。次に、FACS バッファ内のセルを再中断します。
抗体染色の前に、まず氷上の32FCブロッカーで抗マウスCD16で15分間インキュベートすることにより、層状プロプリア細胞の細胞表面をブロックする。次に、抗CX3CR1 PE抗体と氷上の抗PEマイクロビーズを30分間インキュベートし、結合細胞を捕捉し、次にFACSバッファーで細胞を洗浄します。抗体とビーズ結合細胞を磁界の磁気活性化細胞選別カラムを通して通過させ、非結合細胞を除去します。
FACSバッファーで細胞を3回洗浄します。この後、磁場からカラムを取り出し、カラムのプランジャーを押してビーズ結合セルを生成します。まず、氷の上に32FCブロッカーによって抗マウスCD16で層状のプロプリア細胞をブロックします。
抗CD64、CD11c、CD11b、CX3CR1、Ly6CおよびMHCクラスII抗体を用いて細胞をインキュベートすることによって細胞を歪み、次に、テキストプロトコルに概説されているようにFACSフローサイトメーターを使用して細胞をソートする。全RNA調製のために選別された細胞をリセし、サイトカインおよび線維性マーカーを検出する。単離した単一細胞懸濁液から、磁気精製から線維化マーカーおよび炎症性サイトカイン解析のmRNA発現を解析する。
細胞表面染色および分析を開始するには、FACSバッファーの15ミリリットルで500,000と100万の単層プロリア細胞の間で再懸濁します。氷上で1~50の希釈で32抗体を用いて、抗CD16で細胞を10分間インキュベートします。この後、500マイクロリットルの氷冷FACSバッファーで細胞を洗浄し、非結合抗体を除去します。
表面染色大腸単細胞懸濁液は、氷上で1〜100の希釈時に蛍光標識抗体を30分間用いた。標識された細胞を2回洗浄し、洗浄ごとに500マイクロリットルの氷冷FACSバッファーを使用して非結合抗体を除去します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、フローサイトメーターによって標識された単核細胞を分析する。
細胞内サイトカインの染色と分析を開始するには、固定パーメアビライゼーションソリューションキットを使用して、メーカーの指示に従って表面染色された細胞を固定および透過させます。テキストプロトコルに概説されているように、薄層プロプリア細胞をゲートし、IL-1ベータサイトカインの細胞内レベルを検出します。次に、FACSバッファーと遠心分離機をGの200倍と摂氏4度で5分間加えて細胞を洗浄し、余分な固定バッファーを除去します。
この洗浄を一度繰り返します。α平滑筋アクチンレベルを決定するために、まず、パーメアビライゼーション溶液キットの固定で細胞を透過させる。氷上で1~1000の希釈で抗アルファSMAアレクサFluor 488抗体を30分間インキュベートします。
その後、FACSバッファーと遠心分離機をGの200倍と摂氏4度で5分間加えて細胞を洗浄し、余分な固定バッファーを取り除きます。この洗浄を一度繰り返します。FACS 解析を実行し、テキスト プロトコルで説明されているようにセルをゲートします。
本研究では、TNBS大腸炎マウスモデルを採用し、腸線維症の基礎機構を解明する研究を行っています。6週間のTNBS治療の後、TNBS治療の過程で大腸長が対照群の約5センチメートルからTNBS群で約3センチメートルに徐々に短くなっていることが分かる。TNBSクローン病モデルがヒトクローンの線維症モデルに匹敵し、方法論に関連するアーティファクトではないことを保証するために、線維性マーカーは詳細なタイムコース研究で複数のレベルで分析される。
線維症の発生率の大部分でアルファ平滑筋アクチン陽性細胞およびコラーゲン沈着の蓄積が報告されており、TNBS線維症をクローンの関連線維症と比較する線維性事象の特徴と見なされ、線維症マーカーおよびサイトカインの発現は、活性CDまたはリミッション下の患者のイリウムからの新鮮な組織生検で分析される。驚くべきことに、顕著な誘導は、α平滑筋アクチン陽性層の肥厚と活性CD切片におけるコラーゲン沈着の増加の見られる。ウエスタンブロット分析は、活性CDサンプルにおけるα平滑筋アクチン発現の誘導を確認するために行われる。
さらに、線維化マーカーの有意な誘導は、qPCR分析によって検出される。ラパマイシンの効果は、M4活性の薬理学的阻害剤であり、次いで評価され、TNBS線維症を制限するメカニズムを決定する。マウスはTNBSとラパマイシンの両方で処理され、大腸神学におけるα平滑筋アクチンおよびコラーゲンのレベルが分析される。
細胞の生存率を維持するだけでなく、細胞の生存率を維持するだけでなく、細胞の損失を避けるために、各マウスに同じ量のTNBSを接種し、できるだけ早く単離された層状細胞を処理することを覚えておくことが重要です。TNBS線維化と線維化の寛解に関するプロトコルの詳細と同様に線維化形成におけるラパマイシンの抑制因子。他の研究者は、線維症や大腸癌のためのより良い薬物標的を見つけるために、この技術を使用することに興味があるかもしれません.
TNBSは皮膚刺激性であり、ラボコートは皮膚接触を避けるために取り扱い中に着用する必要があることを覚えておいてください。
