פרוטוקול זה מציג פתופיזיולוגיה דומה מאוד של פיברוזיס של קרוהן בבני אדם וגם דן ההשפעות מעכבות rapamycin מתווך על פיברוזיס מעיים. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מתאר התפתחות פיברוזיס מעיים בזמן קצר מאוד משתנה בין ארבעה לשמונה שבועות, אשר נותנים לנו את ההזדמנות ללמוד תיקון רקמות והתחדשות רקמות. פרוטוקול זה יהיה מועיל לחוקרים אשר ממהרים לקבל את המנגנון של פיברוזיס, ולעזור למצוא טק טוב יותר לחזות התערבות עבור פיברוזיס המעי הקשורים של קרוהן.
כדי להתחיל בהליך זה, לגלח עכברים בוגרים סביב אזור הצוואר על מנת לחוש אותם מראש TNBS באמצעות חשיפה עורית. לאחר מכן להשרות ספוגית קוטון עם TNBS ולהחיל אותו על האזור המגולח של צוואר העכבר. שמונה ימים לאחר רגישות, לגרום קוליטיס על ידי ממשל תוך-ירקטאלי פעם בשבוע, במשך שישה שבועות.
כדי לעשות זאת, להחיל ארבעה מיליגרם של TNBS ב 25%אתנול באמצעות חוקן 100 מיקרוליטר באמצעות מזרק מיליליטר אחד מחובר מחט gavage פלדה. תן לעכברי בקרה 100 מיקרוליטר של 25% אתנול בלבד. לאחר הרדמה של העכברים, מוזרקים תוך-פרטית רפאמיצין בשני מיליגרם לקילוגרם ליום, או רכב, או שניהם, בכל יום חול במשך שלושה עד שישה שבועות הן לעכברים המטופלים על ידי TNBS והן לעכברים שטופלו ב- TNBS.
לאחר מכן, השתמשו במעיי עכברים TNBS לאחר טיפול של שישה שבועות לניתוח הראיה החוץ-תאית. ראשית, לפתוח את המעי הגס אורך בקרח קר HBSS ולשטוף את המעי הגס ב HBSS. באמצעות מספריים סטריליים, לחתוך את המעי הגס לחתיכות קטנות כי הם כחמישה סנטימטרים ב HBSS.
מעבירים את חלקי רקמת המעי הגס הקטנים לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של חיץ טרום עיכול. לנער את הצינור ב 100 סל"ד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה דרך מסננת תא 40 מיקרומטר, ולהשליך את האפיתל המעי הגס המצורף.
לאסוף את הרקמה הנותרת מן מסננת ולעכל אותם עוד יותר במאגר העיכול המכיל קולגנס סוג IV ו DNASE1 ב 1X HBSS עם 5% FBS במשך 20 דקות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 100 סל"ד. לאחר מכן, מערבולת הרקמות מתעכל במשך כ 20 שניות ולהעביר אותו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי להשיג שברי למינה פרופריה. צנטריפוגה שברי פרופריה למינה ב 700 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה למטה התאים.
לאחר מכן, בצע 100 מיליליטר של פתרונות מדיה הדרגתית של 30%ו- 70%. תן שימוש חוזר בתאים המתקבלים ב-10 מיליליטר של פתרון ה-30%, ו שכב על כך על גבי חמישה מיליליטר של 70% מהתסרון בצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה שיפוע במצב חופשי הפסקה ב 1, 000 פעמים G וטמפרטורת החדר.
לאסוף את שלב הטבעת הלבנה המכילה את לימפוציטים לימפוציטים למינה פרופריה, אשר יהיה בין 30% ו 70% שיפוע שכבות. לשטוף את התאים המתקבלים על ידי resuspending אותם בקרח קר HBSS ו צנטריפוגה ב 500 פעמים G ו 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים במאגר FACS.
לפני כתמי נוגדנים, ראשית לחסום את פני התא של תאי פרופריה למינה על ידי דגירה אותם עם CD16 נגד עכבר על ידי חוסם 32FC על קרח במשך 15 דקות. הבא דגירה התאים עם נוגדנים נגד CX3CR1 PE יחד עם microbeads אנטי PE על הקרח במשך 30 דקות כדי ללכוד את התאים המאוגדים, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם חיץ FACS. מעבירים את הנוגדן ותאים מאוגדי חרוזים דרך עמודת מיון תאים המופעלת מגנטית בשדה מגנטי כדי להסיר את התאים הלא מאוגדים.
לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מאגר FACS. לאחר מכן, הסר את העמודה מהשדה המגנטי ודחוף את הבוכנה בעמודה כדי להניב את התאים הקשורים לתיבה. ראשית, לחסום את תאי פרופריה למינה עם CD16 נגד עכבר על ידי חוסם 32FC על קרח.
מסננים את התאים על ידי דגירה עם נוגדנים נגד CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C ו- MHC Class II ואז למיין את התאים באמצעות ציטומטר זרימה FACS כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. Lyse התאים ממוינים להכנת RNA הכוללת ולזהות ציטוקינים סמנים פיברוטיים. לנתח ביטוי mRNA של סמנים פיברוטיים וניתוח ציטוקינים דלקתיים מתלים בודדים של תא יחיד מטיהור מגנטי.
כדי להתחיל מכתים וניתוח משטח התא, תן שימוש חוזר בין 500, 000 ומיליון תאי למינה פרופריה מבודדים ב-15 מיליליטר של מאגר FACS. הדגירה את התאים עם אנטי CD16 על ידי 32 נוגדנים בדילול של 1 עד 50 על קרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם 500 microliters של חיץ FACS קר כקרח כדי להסיר נוגדנים לא מאוגדים.
מתלים של כתם המעי הגס עם נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית בדילול של 1 עד 100 על קרח למשך 30 דקות. לשטוף את התאים המסומנים פעמיים כדי להסיר את הנוגדנים מאוגדים באמצעות 500 microliters של חיץ FACS קר כקרח עבור כל לשטוף. לאחר מכן נתח את התאים המונונו-גרעיניים המסומן לפי ציטומטר זרימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
כדי להתחיל בהכתמת ציטוקין תאי וניתוח, השתמש בערכת פתרון קיבעון permeabilization כדי לתקן ולחלחל לתאים מוכתמים על פני השטח על פי הוראות היצרן. שער תאי ההנעה למינה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לזהות את הרמה תאית של IL-1 בטא ציטוקין. לאחר מכן, לשטוף את התאים על ידי הוספת חיץ FACS וצנטריפוגה ב 200 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להסיר מאגר תיקון עודף.
חזור על שטיפה זו פעם אחת. כדי לקבוע את רמת actin שריר חלק אלפא, הראשון לחלחל תאים עם ערכת פתרון קיבעון permeabilization. הדגירה את התאים עם נוגדנים נגד אלפא SMA Alexa Fluor 488 בדילול של 1 עד 1000 על קרח במשך 30 דקות.
לאחר מכן לשטוף את התאים על ידי הוספת חיץ FACS וצנטריפוגה ב 200 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להסיר מאגר תיקון עודף. חזור על שטיפה זו פעם אחת. בצע ניתוח FACS ושער התאים כמסווים בפרוטוקול הטקסט.
במחקר זה מודל העכבר קוליטיס TNBS מאומץ ללמוד ולהבהר את המנגנונים הבסיסיים של פיברוזיס מעיים. לאחר שישה שבועות של טיפול TNBS, ניתן לראות כי אורך המעי הגס התקצר בהדרגה במהלך הטיפול TNBS מחמישה סנטימטרים בקירוב בקבוצת הביקורת לשלושה סנטימטרים בקירוב בקבוצת TNBS. כדי להבטיח שמודל המחלה של הקרוהן TNBS דומה למודל הפיברוזיס של הקרוהן האנושי והוא אינו חפץ הקשור למתודולוגיה, סמנים פיברוטיים מנותחים ברמות מרובות במחקר מסלול זמן מפורט.
הצטברות של שרירי אלפא חלקה actin תאים חיוביים ותצהיר קולגן בתוך שכבות submucosal דווחו ברוב המקרים פיברוזיס ונחשב סימן ההיכר לאירועים פיברוטיים כדי להשוות פיברוזיס TNBS עם פיברוזיס הקשורים של קרוהן, הביטוי של סמני פיברוזיס ציטוקינים מנותח ביופסיה רקמה טרייה מן ileum של חולים עם תקליטור פעיל או תחת remission. למרבה הפלא, אינדוקציה מסומן נראה של עיבוי של אלפא חלק שריר actin שכבות חיוביות תצהיר קולגן מוגברת בקטעי תקליטור פעיל. ניתוח כתם מערבי מבוצע כדי לאשר את אינדוקציה של ביטוי actin שריר חלק אלפא בדגימות תקליטור פעיל.
בנוסף, אינדוקציה משמעותית של סמני פיברוזיס מזוהה על ידי ניתוח qPCR. ההשפעות של rapamycin, מעכב פרמקולוגי של פעילות M4 מוערכים לאחר מכן כדי לקבוע מנגנון להגבלת פיברוזיס TNBS. עכברים מטופלים הן עם TNBS ו rapamycin ואת רמות של אלפא חלקה שריר actin ו קולגן בהיסטולוגיה המעי הגס מנותחים.
חשוב לזכור לחסן את אותה כמות של TNBS לכל עכבר ולעבד תאי לאמינה פרופריה מבודדים בהקדם האפשרי כדי למנוע אובדן תאים, כמו גם כדי לשמור על הכדאיות התא. הפרוטוקול שלנו מפרט על פיברוזיס TNBS והפוגה של פיברוזיס, כמו גם את הגורם המעכב של rapamycin בהיווצרות פיברוזיס. חוקר אחר עשוי להיות מעוניין להשתמש בטכניקה זו כדי למצוא יעד תרופה טובה יותר עבור פיברוזיס וסרטן המעי הגס.
אנא זכרו כי TNBS הוא מגירוי בעור ויש ללבוש חלוקי מעבדה במהלך הטיפול כדי למנוע מגע עם העור.
