Questo protocollo mostra una fisiopatologia altamente comparabile della fibrosi di Crohn nell'uomo e discute anche gli effetti inibitori mediati dalla rapamicina sulla fibrosi intestinale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che descrive lo sviluppo della fibrosi intestinale in un lasso di tempo molto breve che varia da quattro a otto settimane, il che ci dà l'opportunità di studiare la riparazione dei tessuti e la rigenerazione dei tessuti. Questo protocollo sarà utile ai ricercatori che hanno fretta di ottenere il meccanismo della fibrosi e aiuteranno a trovare una tecnologia migliore per prevedere l'intervento per la fibrosi intestinale associata a Crohn.
Per iniziare questa procedura, radere i topi adulti intorno alla zona del collo al fine di pre-sensibilizzarli a TNBS tramite esposizione cutanea. Quindi immergere un tampone coton con TNBS e applicarlo sull'area rasata del collo del topo. Otto giorni dopo la sensibilizzazione, indurre la colite per somministrazione intrarettale una volta alla settimana, per sei settimane.
Per fare ciò, applicare quattro milligrammi di TNBS nel 25% di etanolo utilizzando un clistere da 100 microlitri tramite una siringa millilitro attaccata a un ago di gavage in acciaio. Dare ai topi di controllo solo 100 microlitri del 25% di etanolo. Dopo aver anestetizzato i topi, iniettare per via intraperitoneale rapamicina a due milligrammi al chilogrammo al giorno, o un veicolo, o entrambi, ogni giorno feriale per tre o sei settimane sia al controllo che ai topi trattati con TNBS.
Dopo questo, utilizzare l'intestino dei topi post-trattato TNBS di sei settimane per analizzare i test extracellulari. In primo luogo, aprire il colon longitudinalmente in HBSS ghiacciato e lavare il colon in HBSS. Usando forbici sterili, tagliare il colon in piccoli pezzi che sono circa cinque centimetri in HBSS.
Trasferire i piccoli pezzi di tessuto del colon in un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di tampone pre-digestione. Agitare il tubo a 100 giri/min in un incubatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, passare la sospensione attraverso un colino cellulare di 40 micrometri e scartare l'epitelio colon attaccato.
Raccogliere il tessuto rimanente dal colino e digerirli ulteriormente in un tampone di digestione contenente collagenasi tipo IV e DNASE1 in 1X HBSS con 5%FBS per 20 minuti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius mentre si trema a 100 RPM. Successivamente, vortice i tessuti digeriti per circa 20 secondi e passarlo attraverso un colino cellulare di 40 micrometri per ottenere frazioni di lamina propria. Centrifugare le frazioni di lamina propria a 700 volte G e quattro gradi Celsius per pellettare le cellule.
Quindi, creare 100 millilitri di soluzioni di gradiente di gradiente sia del 30% che del 70%. Rimorsi le celle ottenute in 10 millilitri della soluzione al 30% e sovrapporre questo sopra cinque millilitri della soluzione al 70% in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare la pendenza in condizioni libere a 1.000 volte G e temperatura ambiente.
Raccogli la fase dell'anello bianco contenente i linfociti di lamina propria, che si trova tra il 30% e il 70% di strati gradiente. Lavare le cellule ottenute rimornendo in HBSS ghiacciato e centrifugando a 500 volte G e 10 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi rimospendare le celle nel buffer FACS.
Prima della colorazione degli anticorpi, bloccare prima la superficie cellulare delle cellule di lamina propria incubandole con il blocco CD16 anti-topo da 32FC sul ghiaccio per 15 minuti. Successivamente incubare le cellule con anticorpi anti-CX3CR1 PE insieme a microperline anti-PE sul ghiaccio per 30 minuti per catturare le cellule legate, quindi lavare le cellule con tampone FACS. Passare l'anticorpo e le cellule legate al tallone attraverso una colonna magnetica attivata di smistamento cellulare in un campo magnetico per rimuovere le cellule non associate.
Lavare le celle tre volte con tampone FACS. Successivamente, rimuovere la colonna dal campo magnetico e spingere lo stantuffo nella colonna per ottenere le celle legate alle perline. In primo luogo, bloccare le celle lamina propria con cd16 anti-mouse da 32FC blocker su ghiaccio.
Filtrare le cellule incubando con anticorpi anti-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C e MHC Classe II Quindi ordinare le cellule utilizzando un citometro a flusso FACS come indicato nel protocollo di testo. Lyse le cellule ordinate per la preparazione totale dell'RNA e rilevare citochine e marcatori fibrotici. Analizza l'espressione dell'mRNA dei marcatori fibrotici e l'analisi infiammatoria delle citochine da sospensioni isolate a singola cellula dalla purificazione magnetica.
Per iniziare la colorazione e l'analisi della superficie cellulare, resuspend tra 500.000 e 1 milione di cellule lamina propria isolate in 15 millilitri di tampone FACS. Incubare le cellule con anticorpi anti-CD16 da 32 ad una diluizione da 1 a 50 sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, lavare le cellule con 500 microlitri di tampone FACS ghiacciato per rimuovere gli anticorpi non vincolati.
Sospensione a singola cella colonica a macchia superficiale con anticorpi etichettati fluorescenti con una diluizione da 1 a 100 sul ghiaccio per 30 minuti. Lavare le cellule etichettate due volte per rimuovere gli anticorpi non vincolati utilizzando 500 microlitri di tampone FACS ghiacciato per ogni lavaggio. Quindi analizzare le celle mononucleari etichettate per citometro di flusso come delineato nel protocollo di testo.
Per iniziare la colorazione e l'analisi delle citochine intracellulari, utilizzare un kit di soluzioni di permeabilizzazione di fissazione per fissare e permeabilizzare le celle macchiate di superficie secondo le istruzioni del produttore. Gate le cellule lamina propria come delineato nel protocollo di testo per rilevare il livello intracellulare di IL-1 beta citochina. Quindi, lavare le celle aggiungendo tampone FACS e centrifugando a 200 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti per rimuovere il buffer fissivo in eccesso.
Ripetere questo lavaggio una volta. Per determinare il livello di actina muscolare liscia alfa, prima permeabilizzare le cellule con il kit di soluzioni di permeabilizzazione di fissazione. Incubare le cellule con anticorpi anti-alfa SMA Alexa Fluor 488 con una diluizione da 1 a 1000 sul ghiaccio per 30 minuti.
Quindi lavare le cellule aggiungendo tampone FACS e centrifugando a 200 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti per rimuovere il buffer fissivo in eccesso. Ripetere questo lavaggio una volta. Eseguire l'analisi FACS e eseguire il gate delle celle come descritto nel protocollo di testo.
In questo studio viene adottato il modello di topo di colite TNBS per studiare ed chiarire i meccanismi sottostanti della fibrosi intestinale. Dopo sei settimane di trattamento TNBS, si può vedere che la lunghezza del colon si è accorciata progressivamente nel corso del trattamento TNBS da circa cinque centimetri nel gruppo di controllo a circa tre centimetri nel gruppo TNBS. Per garantire che il modello di malattia del TNBS Crohn sia paragonabile al modello di fibrosi di Crohn umano e non sia un artefatto correlato alla metodologia, i marcatori fibrotici vengono analizzati a più livelli in uno studio dettagliato del corso di tempo.
L'accumulo di alfa levigato agisce muscolare in cellule positive e la deposizione di collagene all'interno degli strati submucosi sono stati riportati nella maggior parte delle incidenze della fibrosi ed è considerato un segno distintivo per gli eventi fibrotici Confrontare la fibrosi TNBS con la fibrosi associata di Crohn, l'espressione di marcatori di fibrosi e citochine viene analizzata nella biopsia dei tessuti freschi dall'ileo dei pazienti con CD attivo o in remissione. Sorprendentemente, si nota una marcata induzione dell'ispessimento dell'alfa liscio dei muscoli negli strati positivi e aumento della deposizione di collagene nelle sezioni CD attive. L'analisi western blot viene eseguita per confermare l'induzione dell'espressione alfa liscia dell'actina muscolare nei campioni cd attivi.
Inoltre, l'induzione significativa dei marcatori di fibrosi viene rilevata dall'analisi qPCR. Gli effetti della rapamicina, un inibitore farmacologico dell'attività M4 vengono quindi valutati per determinare un meccanismo per limitare la fibrosi TNBS. I topi vengono trattati sia con TNBS che con rapamicina e vengono analizzati i livelli di actina muscolare liscia alfa e collagene nell'istologia del colon.
È importante ricordare di inoculare la stessa quantità di TNBS a ciascun topo e di elaborare al più presto cellule isolate di lamina propria per evitare la perdita di cellule e mantenere la vitalità cellulare. I nostri dettagli di protocollo sulla fibrosi TNBS e la remissione della fibrosi, nonché il fattore inibitorio della rapamicina nella formazione di fibrosi. Altri ricercatori possono essere interessati a utilizzare questa tecnica per trovare un bersaglio farmacologico migliore per la fibrosi e il cancro del colon.
Si prega di ricordare che TNBS è irritante per la pelle e i cappotti da laboratorio devono essere indossati durante la manipolazione per evitare il contatto con la pelle.
