该协议证明，我们现在可以在3D癌症模型中详细确定哑压抑制剂的效果。主要优点是采用一种易于和一对一的方法，可以采用这种方法。该技术允许在3D环境中评估癌症研究中的哑压药物，允许在肿瘤环境相关环境中测试药物。
这种方法可用于癌症细胞毒性药物的测试，或者，例如，评估辐射对癌症增殖和细胞迁移的影响。用普通的96孔板练习介质去除步骤和胶原蛋白替代是有用的。此外，在共合显微镜上进行培训也是必不可少的。
这种技术的视觉演示对于研究人员了解球体所需的微妙处理及其在共和显微镜中的使用至关重要。在实验的第一天，有标准培养培养，在这种情况下，U251，准备适当的细胞系。在组织培养罩中，在培养中加入0.5毫升的尝试性脑试增素，使癌细胞增平。
将癌细胞计数在血细胞计上，稀释至每毫升10至第三细胞的浓度为5倍。将细胞悬浮液留在标记清楚的无菌万能管中。通过温和的反转重新暂停细胞，以避免细胞笨拙。
使用移液器将细胞培养的200微升添加到96井板的每个井中。在每个空井中加入 200 个 1X PBS 微升，以避免蒸发。在37摄氏度的培养箱中孵化细胞。
24小时后，通过亮场显微镜检查细胞。细胞系，如胶质瘤癌细胞系，在24小时内在井底形成球状体。再孵育球体48小时，使3D细胞架构形成。
第三天，放置胶原蛋白，5倍培养基，一摩尔氢氧化钠，和一个20毫升的冰管。小心和缓慢地将10.4毫升的冷胶原蛋白加入冷冻培养管。避免气泡。
然后，轻轻加入1.52毫升的冷无菌5X培养培养。避免气泡。使用前，轻轻加入72微升的冷无菌单摩尔氢氧化钠，并将溶液留在冰上。
通过移液轻轻混合，避免气泡。有效的混合会导致介质中颜色从红色更改为橙色红色。将混合物留在冰上直到使用。
接下来，要从第一天准备的 96 井板中去除 190 微升的上流液，请使用移液器，以向井的一侧倾斜。小心不要打扰在井底形成的球体。轻轻将100微升的胶原蛋白混合物加入到每一个井中，在井的一侧下移液。
避免气泡和任何球体扰动。在室温下将剩余的胶原蛋白混合物留在20毫升管中，以评估聚合。在培养箱中孵育板至少10分钟，使胶原蛋白聚合。
当剩余的胶原蛋白变成半固体和海绵状，球体准备用抑制剂治疗。将浓度为2倍的抑制剂加入培养培养的5毫升。移液器 100 微升的介质轻轻地向下每一个井的侧面，以避免球类扰动。
在零小时、24小时、48小时和72小时的时间，通过光场显微镜观察和成像每个球体，以评估药物活动。然后，将盘子返回孵化器。现在，将板放在组织培养罩中，用 100 微升 1X PBS 轻轻更换上流液。
注意不要打扰球体，避免接触胶原蛋白。再重复此洗涤步骤三次。拆下每个井中的最终洗涤液，并在 1X PBS 中用 100 微升 4%甲醛进行更换。
将 96 井板放在实验室工作台上，用铝箔盖住，并在室温下离开 24 小时。第二天，小心地去除甲醛，并更换为1X PBS。再重复三次。
然后，用 100 微升新鲜准备好的 Triton X-100 溶液更换 1X PBS 洗涤液。在室温下孵育30分钟。同时，在50毫升管中用50毫升1X PBS和05%脱脂奶粉准备阻断溶液，并彻底混合。
30 分钟后，取出 Triton X-100，用 1X PBS 洗涤三次。在每个井中加入100微升的阻解溶液，孵育15分钟。接下来，在阻断缓冲液中稀释抗小鼠IgG乙酰化管状蛋白抗体，比例为1比100。
将原抗体阻断缓冲液混合物在15，682倍g下离心5分钟。小心地去除每个井中的阻尼溶液，并从管中加入25至50微升的抗体阻断缓冲液。在黑暗中在室温下孵育一小时。
然后，从每个井中去除抗体溶液，用100微升1X PBS洗涤三次。除任何额外的荧光污渍外，在推荐浓度下稀释阻断缓冲液中的二次抗体。再次，在15，682倍g下离心二次抗体溶液5分钟。
从每个井中去除阻解溶液，并加入25至50微升的二级抗体上流剂。在黑暗中孵育1个半小时，在室温下。去除二次抗体染料溶液，用1X PBS洗涤三次，每井100微升。
用塑料 200 微升移液器将单个胶原蛋白插头小心地举到玻璃滑梯的中心。加入一滴合适的安装剂，以覆盖胶原蛋白塞。将盖玻片放在样品顶部，并在室温下在黑暗中存储幻灯片。
三维球类技术正在增进对药物-肿瘤相互作用的理解，因为它更代表癌症特异性环境。在这项研究中，发现了潜在的抗或亲迁移效应。这在 KNS42 中尤为明显，在控制或处理过的球体中似乎没有迁移。
在10微摩尔的最高抑制剂浓度下观察到细胞死亡。核分裂和迁移细胞在U251细胞中很明显。U251细胞球体有尖峰辐射远离原来的球体，增加细胞四舍五入细胞明显与增加的抑制剂浓度。
在KNS42中观察到微管坍塌和核碎片。具有单细胞尖峰的表状突起表示 KNS42 迁移。在最低的抑制剂浓度，这种表型是明显的，但随着抑制剂浓度的增加而丢失。
将所有试剂留在冰上直到准备就绪至关重要。否则，胶原蛋白开始聚合之前，它已被添加到球体。有空间量化由共和显微镜生成的图像，以评估，例如，哑球药物对细胞形态的影响。
它首次使我们能够确认米格拉静态抑制剂MI-192对微管乙酰化水平的影响，并在细胞迁移方面进一步探讨这一点。在固定步骤处理甲醛时，应格外小心。通常的健康和安全准则适用。
