铁限分枝杆菌产生的细胞外囊泡的分离和特征

该方法允许在严格的低铁条件下培养结核分枝杆菌，从低铁培养物中净化膜囊泡。由于铁限制已知可以刺激膜囊泡的产生，因此该协议产生高丰度的纯膜囊泡，可用于进一步生化或功能测定。当我们演示使用分枝杆菌，非病毒菌株的协议，该协议可以遵循在BSL-2设施使用结核分枝杆菌，致命的菌株。

首先，在塑料容器中溶解5克磷酸磷酸盐、5克L-芦笋、20毫升甘油和2克葡萄糖，在900毫升的去维化水中，准备1升最小介质。使用五个正常氢氧化钠将 pH 调节到 6.8，用去离子水将体积调节为 1 升。然后加入50克金属溷合树脂，在4摄氏度下使用磁搅拌棒轻轻搅拌24小时。

第二天，停止搅拌，让树脂沉淀物约30分钟。通过 22 微米过滤单元（带塑料接收器）进行过滤，对溶液中剩余的树脂进行消毒和去除。现在，补充最低介质每升氯化锌0.5毫克，每升硫酸镁40毫克，每升硫酸锰0.1毫克。

在两毫升分枝杆菌中接种单一聚落的分枝杆菌，辅以 ADN 浓缩。在37摄氏度下与搅拌孵育。当有可见的生长时，提取培养的两毫升，并在分光光度计上测量OD 540。

当 OD 540 达到 0.8 时停止孵育，这表示对数阶段较晚。将 200 微升的晚期对数培养剂传播到分枝杆菌油板上，并辅以 0.2 甘油、0.5%Tween 80 和 ADN。至少接种五个板。

在37摄氏度下孵育板。一周后，细菌的生长是可见的汇合层。然后在低铁最小介质中湿润无菌棉签。

使用此拭子从阿加板中收集细菌。在管中用100毫升的低铁最小介质中接种细菌。收集足够的细菌，准备一个悬挂与OD 540之一。

用低铁最小介质将悬浮液稀释10倍至1升，并分成两个无菌塑料瓶。接下来，将培养的两毫升转移到五毫升培养管。按体积tyloxapol添加10微升10%体积。

在37摄氏度下孵育培养14天。将培养器转移到五个 225 毫升锥形离心管和离心机，温度为 2，850 次 g，在 20 摄氏度下为 7 分钟。用 50 毫升移液器收集培养物，并通过 0.22 微米过滤器进行过滤器消毒。

为了分离 MEV，将培养物过滤转移到放置在 4 摄氏度的搅拌细胞超滤系统中，并通过 100 千吨截止膜以低于 50 PSI 的压力过滤浓缩物。然后在4摄氏度下将浓度培养物以15，000倍g的过滤器离心15分钟，并在聚碳酸酯超离心管中收集上流液。在摄氏4度下将上一代在10万次g下离心两小时。

之后，通过温和的移液，去除上清液，将无菌颗粒重新在一毫升无菌PBS中。在聚丙烯薄壁超离心管底部将 0.5 毫升颗粒悬浮液与 1.5 毫升 60%碘异醇溶液混合。覆盖此 MVE 碘沙醇 45%悬浮液与一毫升 40%35%30%25%和 20% 碘桑醇溶液和一毫升 PBS 的顶部。

在4摄氏度下以10万次g的离心机，18小时。接下来，使用一毫升汉密尔顿注射器收集从顶部开始的一毫升密度梯度分数。用PBS将每个收集的分数稀释到20毫升，在4摄氏度下以10万倍g的离心机稀释两小时。

取出0.5毫升PBS中的上上液和重新暂停。将管子存放在摄氏四度。为了进行膜脂质分析，将每个梯度分数的10微升与荧光膜探针TMA-DPH结合，最终浓度为每毫升1微克，在96孔黑板的每个孔中每毫升PBS中含量为1微克。

在33摄氏度下孵育板20分钟。测量荧光在360纳米的激发和430纳米的排放。在该协议中，MEV通过密度梯度的差分沉积进行纯化。

在所述条件下，MEV主要以梯度分数三分离，对应于25%的碘桑醇。囊泡相关蛋白质集中在点印分析显示的分数三中。负染色也证实了第三部分中存在 MEV，纳米粒子分析表明，MEV的大小约为 100 纳米。

蛋白质和脂质浓度正常化为菌落形成单位，相对于高铁条件，低铁的 MEV 产量增加了约八倍。点印迹分析表明，与铁足够的 MTB 培养物不同，来自铁有限 MTB 培养物的 MEV 相关标记的强信号。按照说明制备最小介质，以确保铁有限的条件，并防止膜囊泡与脂蛋白聚合物污染。

以这种方式纯化的分枝杆菌囊泡可用于生化特性和功能分析。