Этот метод позволяет культивировать микобактерии туберкулеза в строгих условиях низкого железа и очищать мембранные пузырьки от фильтрата низкой железной культуры. Поскольку ограничение железа, как известно, стимулирует производство мембранных пузырьков, этот протокол дает высокое изобилие чистых мембранных пузырьков, которые могут быть использованы для дальнейших биохимических или функциональных анализов. Когда мы демонстрируем протокол с использованием Mycobacterium smegmatis, невирулянтного штамма, этот протокол может следовать в учреждениях BSL-2 с использованием микобактерий туберкулеза, вирулентного штамма.
Для начала приготовьте один литр минимальной среды, растворив пять граммов монопотассиума фосфата, пять граммов L-аспарагина, 20 миллилитров глицероля и два грамма декстрозы в 900 миллилитров деионизированной воды в пластиковой таре. Отрегулируйте рН до 6,8 с пятью нормальными гидроксидами натрия и отрегулируйте объем до одного литра с деионизированной водой. Затем добавьте 50 граммов металлической хелатной смолы и аккуратно агитигитив с помощью магнитного батончика в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия.
На следующий день, остановить перемешивание и пусть смолы осадок около 30 минут. Стерилизовать и удалить оставшуюся смолу из раствора путем фильтрации через блок фильтра 22 микрона с пластиковым приемником. Теперь дополните минимальную среду 0,5 миллиграммами на литр хлорида цинка, 40 миллиграммами на литр сульфата магния и 0,1 миллиграмма на литр сульфата марганца.
Привить одну колонию МТБ в два миллилитров микобактериального бульона среды, дополненной обогащением ADN. Инкубация с возбуждением при 37 градусах по Цельсию. Когда есть видимый рост, извлечь два миллилитров культуры и измерить OD 540 на спектрофотометре.
Остановите инкубацию, когда OD 540 достигнет 0,8, что указывает на поздную логаритмическую фазу. Распространение 200 микролитров поздней логаритмической культуры на микобактериальные агарные пластины, дополненные 0,2 глицеролом, 0,5%Tween 80 и ADN. Прививать не менее пяти пластин.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию. И через неделю рост бактерий виден как стечение слоя. Затем промокнуть стерильный ватный тампон в низкой железа минимальной среде.
Используйте этот тампон для сбора бактерий из агар пластин. Прививка бактерий в 100 миллилитров низкого железа минимальных средств массовой информации в трубке. Соберите достаточное количество бактерий, чтобы подготовить подвеску с OD 540 одного.
Разбавить подвеску 10 раз до одного литра с низким содержанием железа минимальной среде и разделить его на две стерильные пластиковые бутылки. Затем перенесите два миллилитров культуры в пятими миллилитровую культурную трубку. Добавьте 10 микролитров объемом 10% по объему тилоксаполя.
Инкубировать культуры при 37 градусах по Цельсию в течение 14 дней. Перенесите культуру на пять 225 миллилитров конических центрифуг и центрифуг при 2, 850 раз г в течение семи минут при 20 градусах по Цельсию. Соберите супернатант культуры с помощью 50-миллилитровой пипетки и процберите ее через фильтр 0,22 микрона.
Чтобы изолировать MEV, перенесите филтрат культуры в перемешиваемую систему ультрафильтрации клеток, расположенную при четырех градусах Цельсия, и фильтруем концентрат под давлением менее 50 PSI через мембрану отсечения 100 килодальтонов. Затем центрифуга концентрированной культуры фильтрата на 15000 раз г в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию и собирать супернатант в поликарбонат ультрацентрифугации труб. Центрифугировать супернатант при 100 000 раз г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.
После этого, удалить супернатант и повторно membranous гранулы в общей сложности один миллилитр стерильных PBS нежной пипетки. Смешайте 0,5 миллилитров подвески гранул с 1,5 миллилитров 60%йодиксанола раствора в нижней части полипропилена тонкой стеной ультрацентрифуг трубки. Наложение этого MVE йодиксанол 45%подвеска с одним миллилитр 40%35%30%25%и 20%iodixanol решений и один миллилитр PBS в верхней части.
Центрифуга при 100 000 раз г в течение 18 часов при четырех градусах Цельсия. Далее используйте один миллилитр Гамильтон шприц для сбора одного миллилитра плотности градиентных фракций, начиная с самого верха. Разбавить каждую собранную фракцию до 20 миллилитров с помощью PBS и центрифуги при 100 000 раз г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.
Удалите супернатант и resuspend в 0,5 миллилитров PBS. Храните трубки при четырех градусах по Цельсию. Для проведения мембранного липидного анализа объедините 10 микролитров каждой градиентной фракции с флуоресцентным мембранным зондом TMA-DPH при конечной концентрации одного микрограмма на миллилитр в 50 микролитров PBS в каждом колодец 96-ну черной пластины.
Инкубировать пластины при 33 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Измерьте флуоресценцию на 360 нанометров для возбуждения и 430 нанометров для эмиссии. В этом протоколе МВВ были очищены дифференциальной осадочной установкой в градиенте плотности.
В описанных условиях, MEVs были разделены в основном в градиентной фракции три, которая соответствует 25%iodixanol. Связанные с везикулом белки были сконцентрированы во фракции 3, показанной анализом точечной помарки. Отрицательное окрашивание также подтвердило наличие МЕВ во фракции три и анализ наночастиц показал, что размер МВВ составляет около 100 нанометров.
Концентрация белка и липидов, нормализованная для колоний, показала примерно восьмикратное увеличение урожайности МЕВ в низком железе по сравнению с высокими условиями железа. Анализ помарки точки показал более интенсивный сигнал от MEV-связанных маркеров в фракциях градиента плотности от культуры mTB утюга лимитированную чем от культур MTB утюга достаточных. Следуйте инструкциям по подготовке минимальной среды для обеспечения железа ограниченных условий и предотвращения загрязнения мембранных пузырьков липопротеинов агрегатами.
Микобактериальные мембранные пузырьки, очищенные таким образом, могут быть использованы для биохимической характеристики и функционального анализа.
