Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis unter strengen eisenarmen Bedingungen und die Reinigung von Membranbläschen aus dem Filtrat der niedrigen Eisenkultur. Da Eisenbegrenzung bekannt ist, um Membran Vesikelproduktion zu stimulieren, liefert dieses Protokoll eine hohe Fülle von reinen Membranvesikeln, die für weitere biochemische oder funktionelle Assays verwendet werden können. Wenn wir das Protokoll mit dem Mycobacterium smegmatis, dem nicht virulenten Stamm, demonstrieren, kann dieses Protokoll in BSL-2-Einrichtungen mit Mycobacterium tuberculosis, dem virulenten Stamm, befolgt werden.
Zu Beginn bereiten Sie einen Liter minimales Medium vor, indem Sie fünf Gramm Monokaliumphosphat, fünf Gramm L-Asparagin, 20 Milliliter Glycerin und zwei Gramm Dextrose in 900 Milliliter entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit fünf normalen Natriumhydroxiden auf 6,8 ein und stellen Sie das Volumen mit entionisiertem Wasser auf einen Liter ein. Dann fügen Sie 50 Gramm Metall chelatisierendes Harz und sanft mit einem magnetischen Rührstab für 24 Stunden bei vier Grad Celsius rühren.
Am nächsten Tag das Rühren abbrechen und das Harz für ca. 30 Minuten sedimentieren lassen. Sterilisieren und entfernen Sie das restliche Harz aus der Lösung durch Filtration durch eine 22-Mikron-Filtereinheit mit einem Kunststoffempfänger. Jetzt, ergänzung minimale Mittel mit 0,5 Milligramm pro Liter Zinkchlorid, 40 Milligramm pro Liter Magnesiumsulfat, und 0,1 Milligramm pro Liter Mangansulfat.
Impfen Sie eine einzelne Kolonie von MTB in zwei Milliliter mykobakteriellen Brühe Medium mit ADN-Anreicherung ergänzt. Mit Aufregung bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wenn es sichtbares Wachstum gibt, extrahieren Sie zwei Milliliter der Kultur und messen Sie die OD 540 auf einem Spektralphotometer.
Beenden Sie die Inkubation, wenn die OD 540 0,8 erreicht, was auf die späte logarithmische Phase hinweist. Verteilen Sie 200 Mikroliter der späten logarithmischen Kultur auf die mykobakteriellen Agarplatten, ergänzt durch 0,2 Glycerin, 0,5%Tween 80 und ADN. Impfen Sie mindestens fünf Platten.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius. Und nach einer Woche ist das Bakterienwachstum als Konfluentschicht sichtbar. Dann nass einen sterilen Wattestäbchen in einem niedrigen Eisen minimalmedium.
Verwenden Sie diesen Tupfer, um Bakterien aus den Agarplatten zu sammeln. Impfen Sie die Bakterien in 100 Milliliter neines niedrigen Eisen minimalen Medium in einer Röhre. Sammeln Sie genügend Bakterien, um eine Suspension mit einem OD 540 von einem vorzubereiten.
Verdünnen Sie die Suspension 10 Mal auf einen Liter mit niedrigem Eisen minimal medium und teilen Sie es in zwei sterile Kunststoffflaschen. Als nächstes übertragen Sie zwei Milliliter der Kultur auf eine Fünf-Milliliter-Kulturröhre. Fügen Sie 10 Mikroliter von 10% Volumen volumenmäßig tyloxapol hinzu.
Bebrüte die Kulturen 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Kultur auf fünf 225 Milliliter konische Zentrifugenrohre und Zentrifuge bei 2, 850 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Sammeln Sie den Kulturüberstand mit einer 50-Milliliter-Pipette und filtern Sie ihn durch einen 0,22-Mikron-Filter.
Um MEVs zu isolieren, übertragen Sie das Kulturfiltrat in ein gerührtes Zell-Ultrafiltrationssystem, das bei vier Grad Celsius platziert ist, und filtern Sie das Konzentrat bei einem Druck von weniger als 50 PSI durch eine 100-Kilodalton-Cutoff-Membran. Dann zentrifugieren Sie das konzentrierte Kulturfiltrat bei 15.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand in Polycarbonat-Ultrazentrifugationsröhrchen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 mal g für zwei Stunden bei vier Grad Celsius.
Danach entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die membranösen Pellets in insgesamt einem Milliliter sterilen PBS durch sanftes Pipettieren wieder aus. Mischen Sie 0,5 Milliliter der Pelletsuspension mit 1,5 Milliliter60%Iodixanol-Lösung an der Unterseite eines Polypropylen dünnwandigen Ultrazentrifugenrohrs. Überlagern Sie diese MVE-Iodixanol 45%Suspension mit einem Milliliter von 40%35%30%25%und 20%iodixanol Lösungen und einem Milliliter PBS an der Spitze.
Zentrifuge bei 100.000 mal g für 18 Stunden bei vier Grad Celsius. Als nächstes verwenden Sie eine 1 Milliliter Hamilton Spritze, um die Ein-Milliliter-Dichtegradientenfraktionen von oben zu sammeln. Verdünnen Sie jede gesammelte Fraktion auf 20 Milliliter mit PBS und Zentrifuge bei 100. 000 mal g für zwei Stunden bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 0,5 Milliliter PBS wieder auf. Bewahren Sie die Rohre bei vier Grad Celsius auf. Um eine Membranlipidanalyse durchzuführen, kombinieren Sie 10 Mikroliter jeder Gradientenfraktion mit der fluoreszierenden Membransonde TMA-DPH in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter in 50 Mikroliter PBS in jedem Brunnen einer 96-Well-Schwarzen Platte.
Inkubieren Sie die Platten bei 33 Grad Celsius für 20 Minuten. Messen Sie die Fluoreszenz bei 360 Nanometern für die Anregung und 430 Nanometer für die Emission. In diesem Protokoll wurden MEVs durch Differentialsedimentation in einem Dichtegradienten gereinigt.
Unter den beschriebenen Bedingungen wurden MEVs meist in Gradientenfraktion drei getrennt, was 25% Iodixanol entspricht. Vesikelassoziierte Proteine konzentrierten sich in Fraktion drei, die durch Punktfleckanalyse gezeigt wurde. Negative Färbung bestätigte auch das Vorhandensein von MEVs in Fraktion drei und Nanopartikel-Analysen zeigten, dass die Größe von MEV etwa 100 Nanometer betrug.
Die zu Kolonien bildende Einheiten normalisierte Protein- und Lipidkonzentration zeigte einen etwa achtfachen Anstieg der MEV-Ausbeute bei niedrigem Eisengehalt im Verhältnis zu hohen Eisenbedingungen. Die Punktblot-Analyse zeigte ein intensiveres Signal von MEV-assoziierten Markern in Dichtegradientenfraktionen aus eisenbegrenzter MTB-Kultur als von eisenreichen MTB-Kulturen. Befolgen Sie die Anweisungen zur Herstellung des minimalen Mediums, um eisenbegrenzte Bedingungen zu gewährleisten und eine Kontamination der Membranbläschen mit Lipoproteinaggregaten zu verhindern.
Die auf diese Weise gereinigten mykobakteriellen Membranbläschen können für die biochemische Charakterisierung und funktionelle Analyse verwendet werden.
