Este método permite cultivar Mycobacterium tuberculosis sob estritas condições de ferro baixo e purificar vesículas de membrana a partir do filtrado de cultura de baixo ferro. Como a limitação do ferro é conhecida por estimular a produção de vesículas de membrana, este protocolo produz alta abundância de vesículas de membrana pura que podem ser utilizadas para outros ensaios bioquímicos ou funcionais. Quando demonstramos o protocolo usando o Mycobacterium smegmatis, a cepa não virgem, este protocolo pode ser seguido em instalações BSL-2 usando Mycobacterium tuberculosis, a cepa virulenta.
Para começar, prepare um litro de meio mínimo dissolvendo cinco gramas de fosfato monopotássio, cinco gramas de L-asparagine, 20 mililitros de glicerol e dois gramas de dextrose em 900 mililitros de água desionizada em um recipiente plástico. Ajuste o pH para 6,8 com cinco hidróxido de sódio normais e ajuste o volume para um litro com água deionizada. Em seguida, adicione 50 gramas de resina de quesina metálica e agitar suavemente usando uma barra de agitação magnética por 24 horas a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, pare a agitação e deixe o sedimento de resina por cerca de 30 minutos. Esterilize e remova a resina restante da solução através de uma unidade de filtro de 22 mícrons com um receptor plástico. Agora, suplemente o meio mínimo com 0,5 miligramas por litro de cloreto de zinco, 40 miligramas por litro de sulfato de magnésio e 0,1 miligramas por litro de sulfato de manganês.
Inocular uma única colônia de MTB em dois mililitros de caldo micobacteriano complementado com enriquecimento ADN. Incubar com agitação a 37 graus Celsius. Quando houver crescimento visível, extraia dois mililitros da cultura e mede o OD 540 em um espectógrafo.
Pare a incubação quando o OD 540 atingir 0,8, o que indica a fase logarítmica tardia. Espalhe 200 microlitadores da cultura logarítmica tardia nas placas de ágar micobacteriano suplementadas com 0,2 glicerol, 0,5% Tween 80 e ADN. Inocular pelo menos cinco pratos.
Incubar as placas a 37 graus Celsius. E depois de uma semana, o crescimento bacteriano é visível como uma camada confluente. Em seguida, molhe um cotonete estéril em um meio mínimo de ferro baixo.
Use este cotonete para coletar bactérias das placas de ágar. Inocular a bactéria em 100 mililitros de baixa mídia de ferro mínimo em um tubo. Colete bactérias suficientes para preparar uma suspensão com um OD 540 de um.
Diluir a suspensão 10 vezes para um litro com meio mínimo de ferro baixo e dividi-la em duas garrafas plásticas estéreis. Em seguida, transfira dois mililitros da cultura para um tubo de cultura de cinco mililitros. Adicione 10 microliters de 10% de volume por volume tyloxapol.
Incubar as culturas a 37 graus Celsius por 14 dias. Transfira a cultura para cinco tubos de centrífuga cônica de 225 mililitros e centrífuga a 2.850 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Colete a supernascercultura cultural com uma pipeta de 50 mililitros e esterilize-a através de um filtro de 0,22 mícrons.
Para isolar os MEVs, transfira o filtrado da cultura para um sistema de ultrafiltração celular agitado colocado a quatro graus Celsius e filtre o concentrado a uma pressão inferior a 50 PSI através de uma membrana de corte de 100 kilodalton. Em seguida, centrifugar a cultura concentrada filtrar a 15.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius e coletar o supernascido em tubos de ultracentrifugação de policarbonato. Centrifugar o supernante a 100.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius.
Depois disso, remova o supernaspe e resuspenda as pelotas membranous em um total de um mililitro de PBS estéril por tubulação suave. Misture 0,5 mililitros da suspensão da pelota com 1,5 mililitros de solução de 60% iodixanol na parte inferior de um tubo ultracentrifuge de parede fina de polipropileno. Sobreponha esta suspensão de Iodixanol MVE de 45% com um mililitro de 40%35%30%25% e 20% de soluções iodixanol e um mililitro de PBS no topo.
Centrifugar a 100.000 vezes g por 18 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, use uma seringa Hamilton de um mililitro para coletar as frações de gradiente de densidade de um mililitro a partir do topo. Diluir cada fração coletada para 20 mililitros com PBS e centrífuga a 100.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante e resuspend em 0,5 mililitros de PBS. Armazene os tubos a 4 graus Celsius. Para realizar a análise lipídica da membrana, combine 10 microliters de cada fração gradiente com a sonda de membrana fluorescente TMA-DPH em uma concentração final de um micrograma por mililitro em 50 microlitrais de PBS em cada poço de uma placa preta de 96 poços.
Incubar as placas a 33 graus Celsius por 20 minutos. Meça a fluorescência em 360 nanômetros para excitação e 430 nanômetros para emissão. Neste protocolo, os MEVs foram purificados por sedimentação diferencial em um gradiente de densidade.
Nas condições descritas, os MEVs foram separados principalmente na fração de gradiente três, o que corresponde a 25% de iodixanol. As proteínas associadas à vesícula foram concentradas na fração três mostrada pela análise da mancha de ponto. A coloração negativa também confirmou a presença de MEVs na fração três e a análise de nanopartículas mostrou que o tamanho do MEV era de cerca de 100 nanômetros.
A concentração de proteínas e lipídios normalizada para unidades formadoras de colônias mostrou um aumento de aproximadamente oito vezes no rendimento de MEV em ferro baixo em relação às altas condições de ferro. A análise da mancha de ponto mostrou um sinal mais intenso de marcadores associados ao MEV em frações de gradiente de densidade da cultura MTB limitada de ferro do que de culturas MTB suficientes de ferro. Siga as instruções para a preparação do meio mínimo para assegurar condições limitadas de ferro e evitar a contaminação das vesículas da membrana com agregados de lipoproteína.
As vesículas da membrana micobacteriana purificadas desta forma podem ser utilizadas para caracterização bioquímica e análise funcional.
