שיטה זו מאפשרת culturing שחפת Mycobacterium בתנאי ברזל נמוכים קפדניים וטיהור וריתי קרום מן הסינון תרבות ברזל נמוכה. מכיוון שמגבלת הברזל ידועה כמעוררת ייצור ורירית הממברנה, פרוטוקול זה מניב שפע גבוה של ורי ורי ממברנה טהורים שניתן לנצל לצורך בדיקות ביוכימיות או תפקודיות נוספות. כאשר אנו מדגימים את הפרוטוקול באמצעות Smegmatis Mycobacterium, הזן הלא ארסי, פרוטוקול זה יכול להיות אחריו במתקני BSL-2 באמצעות שחפת Mycobacterium, הזן ארסי.
כדי להתחיל, להכין ליטר אחד של מדיום מינימלי על ידי המסת חמישה גרם של מונופוטזיום פוספט, חמישה גרם של L-אספרגן, 20 מיליליטר של גליצרול, ושני גרם של דקסטרוז ב 900 מיליליטר של מים deionized במיכל פלסטיק. כוונן את ה- pH ל- 6.8 עם חמישה נתרן הידרוקסידי רגיל והתאם את הנפח לליטר אחד עם מים לא מיונים. לאחר מכן מוסיפים 50 גרם של שדון כלאט מתכת בעדינות להתסיס באמצעות מוט ערבוב מגנטי במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, להפסיק את ערבוב ולתת את המזרק שף במשך כ 30 דקות. לעקר ולהסיר את השדר הנותר מהפתרון על ידי סינון באמצעות יחידת סינון 22 מיקרון עם מקלט פלסטיק. עכשיו, תוספת בינונית מינימלית עם 0.5 מיליגרם לליטר אבץ כלורי, 40 מיליגרם לליטר מגנזיום גופרתי, ו 0.1 מיליגרם לליטר של סולפט מנגן.
לחסן מושבה אחת של MTB בשני מיליליטר של מדיום מרק mycobacterial בתוספת העשרה ADN. דגירה עם תסיסה ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר יש צמיחה גלויה, לחלץ שני מיליליטר של התרבות ולמדוד את OD 540 על ספקטרופוטומטר.
הפסק את הדגירה כאשר OD 540 מגיע ל- 0.8 המציין את השלב הלוגיתמי המאוחר. מורחים 200 מיקרוליטרים של התרבות הלוגאריתמית המאוחרת על לוחות אגר מיקובקטריאליים בתוספת 0.2 גליצרול, 0.5% Tween 80 ו- ADN. לחסן לפחות חמש צלחות.
הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס. ואחרי שבוע, צמיחת החיידקים נראית כשכבה נוחה. ואז להרטיב צמר גפן סטרילי במדיום מינימאלי ברזל נמוך.
השתמש ספוגית זו כדי לאסוף חיידקים מצלחות אגר. לחסן את החיידקים ב 100 מיליליטר של ברזל נמוך מדיה מינימלית בצינור. לאסוף חיידקים מספיק כדי להכין השעיה עם OD 540 של אחד.
מדללים את ההשעיה 10 פעמים לליטר אחד עם ברזל נמוך בינוני מינימלי ומחלקים אותו לשני בקבוקי פלסטיק סטריליים. לאחר מכן, להעביר שני מיליליטר של התרבות לצינור תרבות חמישה מיליליטר. הוסף 10 מיקרוליטרים של 10%volume לפי tyloxapol נפח.
הדגירה את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14 ימים. מעבירים את התרבות לחמישה צינורות צנטריפוגה חרוטיים 225 מיליליטר וצנטריפוגה ב 2, 850 פעמים g במשך שבע דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאסוף את התרבות supernatant עם פיפטה 50 מיליליטר ולסנן לעקר אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרון.
כדי לבודד MEVs, להעביר את סינון התרבות לתוך מערכת אולטרה סינון תאים מעורבב ממוקם בארבע מעלות צלזיוס ולסנן את הריכוז בלחץ פחות מ 50 PSI דרך קרום ניתוק 100 קילודלטון. ואז צנטריפוגה התרבות המרוכזת לסינון ב 15, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינורות אולטרה צנטריפוגה פוליקרבונט. צנטריפוגה supernatant ב 100, 000 פעמים גרם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את כדורי קרום בסך הכל מיליליטר אחד של PBS סטרילי על ידי צינורות עדינים. מערבבים 0.5 מיליליטר של ההשעיה גלולה עם 1.5 מיליליטר של 60% פתרון יודיקסנול בחלק התחתון של צינור אולטרה צנטריפוגה דק פוליפרופילן מוקף חומה. שכבת-על זו MVE iodixanol 45%ההשעיה עם מיליליטר אחד של 40%35%30%25%ו 20%iodixanol פתרונות אחד של PBS בחלק העליון.
צנטריפוגה ב 100, 000 פעמים g במשך 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש במזרק המילטון מיליליטר אחד כדי לאסוף את שברי שיפוע צפיפות מיליליטר אחד החל מלמעלה. לדלל כל שבר שנאסף ל 20 מיליליטר עם PBS וצנטריפוגה ב 100, 000 פעמים g במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.
הסר את supernatant ו resuspend ב 0.5 מיליליטר של PBS. אחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע ניתוח שומנים בקרום, לשלב 10 microliters של כל שבר שיפוע עם בדיקה קרום פלואורסצנטי TMA-DPH בריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר ב 50 microliters של PBS בכל באר של צלחת שחורה 96 היטב.
הדגירה את הצלחות ב 33 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. למדוד את הפלואורסצנטיות ב 360 ננומטר עבור העירור ו 430 ננומטר עבור פליטה. בפרוטוקול זה, MEVs טוהרו על ידי מעים דיפרנציאליים במילוי הדרגתי של צפיפות.
תחת התנאים המתוארים, MEVs הופרדו בעיקר בשבר שיפוע שלוש אשר תואם 25%iodixanol. חלבונים הקשורים ל- Vesicle התרכזו בשבריר שלוש המוצג על ידי ניתוח כתמי נקודה. כתמים שליליים אישרו גם את נוכחותם של כלי רכב חשמליים בשבר שלוש וניתוח חלקיקים הראה שגודל ה- MEV היה בסביבות 100 ננומטר.
ריכוז החלבון ושומנים מנורמל ליחידות יוצרות המושבה הראה עלייה של כשמונה פעמים של תפוקת MEV בברזל נמוך ביחס לתנאי ברזל גבוהים. ניתוח כתם נקודה הראה אות אינטנסיבי יותר מסמנים הקשורים ל- MEV בשברים הדרגתיים בצפיפות מתרבות MTB מוגבלת מברזל מאשר מתרבויות MTB מספיקות מברזל. בצע את ההוראות להכנת המדיום המינימלי כדי להבטיח תנאים מוגבלים ברזל ולמנוע זיהום של ורידים קרום עם אגרגטים lipoprotein.
ורי הווסיקים הממברניים המטוהרים באופן זה יכולים לשמש לאפיון ביוכימי וניתוח תפקודי.
