이 방법은 엄격한 낮은 철 조건에서 균균 결핵을 배양하고 낮은 철 배양 여과에서 막 소포를 정화할 수 있습니다. 철 제한은 막 소포 생산을 자극하는 것으로 알려져 있기 때문에,이 프로토콜은 추가 생화학적 또는 기능적 분석을 위해 활용할 수있는 순수한 멤브레인 소포의 높은 풍부를 산출한다. 우리는 진균 세균염, 비룰런트 균주를 사용하여 프로토콜을 시연 할 때, 이 프로토콜은 진균 결핵, 악성 균주를 사용하여 BSL-2 시설에서 수행 될 수있다.
우선, 5그램의 모노포타슘 인산염, L-아스파라진 5그램, 글리세롤 20밀리리터, 플라스틱 용기에 900밀리리터의 덱스트로스 2그램을 용해하여 최소 배지 1리터를 준비한다. 5개의 일반 수산화나트륨으로 pH를 6.8로 조정하고 탈온화된 물로 1리터로 부피를 조절한다. 그런 다음 50그램의 금속 킬라팅 수지와 자기 저어바를 사용하여 섭씨 4도에서 24시간 동안 부드럽게 교반합니다.
다음 날, 교반을 멈추고 수지 퇴적물을 약 30 분 동안 놓습니다. 플라스틱 수신기가 있는 22 미크론 필터 장치를 통해 여과하여 용액에서 남은 수지물을 살균하고 제거합니다. 이제 염화 아연 리터당 0.5 밀리그램, 황산 마그네슘 리터당 40밀리그램, 망간 황산염 리터당 0.1밀리그램으로 최소 배지를 보충하십시오.
ADN 농축액으로 보충된 진균 국물 배지의 2밀리리터에 MTB의 단일 콜로니를 접종합니다. 섭씨 37도에서 동요로 배양하십시오. 눈에 보이는 성장이있을 때, 문화의 두 밀리리터를 추출하고 분광계에 OD 540을 측정합니다.
OD 540이 0.8에 도달하면 배양을 중지하여 후기 로그산스믹 단계를 나타냅니다. 0.2 글리세롤, 0.5%Tween 80 및 ADN으로 보충된 진균 식천 접시에 후기 로고산계 배양 200마이크로리터를 확산시켰다. 적어도 5 개의 플레이트를 접종하십시오.
섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 그리고 1 주일 후, 세균 성장은 수렴 층으로 볼 수 있습니다. 그런 다음 멸균 면봉을 낮은 철에 최소한의 매체로 적시어.
이 면봉을 사용하여 한천 접시에서 박테리아를 수집하십시오. 튜브에 낮은 철 최소 매체의 100 밀리리터에 박테리아를 접종. OD 540으로 현탁액을 준비하기에 충분한 박테리아를 수집합니다.
서스펜션을 1리터에서 1리터로 낮게 희석하고 중간 크기로 희석하고 멸균 플라스틱 병 2개로 나눕니다. 다음으로, 문화의 2 밀리리터를 5밀리리터 배양 튜브로 옮는다. 볼륨 타이록사폴에 의해 10% 볼륨의 마이크로리터 10을 추가합니다.
14일 동안 섭씨 37도에서 문화를 배양합니다. 문화를 섭씨 20도에서 7분간 225밀리리터 원심분리기 튜브와 원심분리기 5개로 옮기십시오. 50 밀리리터 파이펫으로 배양 상체를 수집하고 필터는 0.22 미크론 필터를 통해 살균합니다.
MEV를 분리하기 위해 배양 여과를 섭씨 4도에 배치한 교반세포 초여과 시스템으로 옮기고 100킬로달톤 차단막을 통해 50PSI 미만의 압력으로 농축물을 필터링한다. 그런 다음 농축 배양 여과를 섭씨 4도에서 15분 동안 15배, 000배에서 원심분리하고 폴리카보네이트 극심분리관에서 상퍼탄을 수집한다. 상심분리는 섭씨 4도에서 2시간 동안 100, 000배g에서 상피합니다.
그 후, 상체를 제거하고 부드러운 파이펫팅에 의해 멸균 PBS의 총 1 밀리리터에서 음골 펠릿을 다시 중단합니다. 폴리프로필렌 얇은 벽초센심분리기 튜브 의 바닥에 60%의 iodixanol 용액의 1.5 밀리리터와 펠릿 서스펜션의 0.5 밀리리터를 혼합합니다. 이 MVE iodixanol 45% 서스펜션과 40%35%30%25%,20%의 iodixanol 솔루션과 1밀리리터의 PBS를 상단에 오버레이합니다.
원심분리기는 섭씨 4도에서 18시간 동안 100g, 000배. 다음으로, 1 밀리리터 해밀턴 주사기를 사용하여 상단에서 시작하여 밀리리터 밀도 그라데이션 분획1개를 수집합니다. 수집된 각 분획을 PBS와 원심분리기로 20밀리리터로 희석하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 000배 씩 PBS와 원심분리기를 희석합니다.
PBS의 0.5 밀리리터에서 상체를 제거하고 다시 중단하십시오. 튜브를 섭씨 4도에 보관하십시오. 멤브레인 지질 분석을 수행하기 위해 각 그라데이션 분획의 10 마이크로리터를 형광막 프로브 TMA-DPH와 결합하여 96웰 블랙 플레이트의 각 웰에 있는 PBS의 50 마이크로리터에 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도를 결합합니다.
플레이트를 섭씨 33도에서 20분간 배양합니다. 발광을 위해 360 나노미터및 430 나노미터의 방출을 측정합니다. 이 프로토콜에서 MEV는 밀도 그라데이션에서 차동 침전에 의해 정제되었다.
설명된 조건하에서, MEV는 25%iodixanol에 대응하는 그라데이션 분획 3에서 주로 분리되었다. 소포 관련 단백질은 도트 블롯 분석에 의해 표시된 분획 3개에 집중되었다. 부정적인 염색은 또한 3분분및 나노입자 분석에서 MEV의 존재를 확인했으며 MEV의 크기는 약 100 나노미터였다.
콜로니 성형 단위로 정규화된 단백질 및 지질 농도는 높은 철 조건에 비해 낮은 철에서 MEV 수율의 약 8배 증가를 나타냈다. 도트 블롯 분석은 철에 충분한 MTB 배양보다 철 제한된 MTB 배양에서 밀도 그라데이션 분획에 있는 MEV 관련 마커로부터 보다 강렬한 신호를 보였다. 최소 배지의 준비 지침은 철 제한 조건을 보장하고 지단백질 골재로 막 소포의 오염을 방지합니다.
이러한 방식으로 정제된 진균막 소포는 생화학적 특성화 및 기능분석에 사용될 수 있다.
