この方法は、厳格な低鉄条件下で結核菌を培養し、低鉄培養液から小胞膜を浄化することを可能にする。鉄の制限は膜小胞の産生を刺激することが知られているので、このプロトコルは、さらに生化学的または機能的なアッセイに利用することができる純粋な膜小胞の高い豊富さを生み出す。我々は、マイコバクテリウムスメグマティス、非毒性株を使用してプロトコルを実証する場合、このプロトコルは、結核菌、悪質株を使用してBSL-2施設に従うことができます。
まず、5グラムのリン酸モノカリウム、5グラムのL-アスパラギン、20ミリリットルのグリセロール、900ミリリットルの脱イオン水に2グラムのデキストロースをプラスチック容器に溶解させることで、最小限の培地を1リットル用意します。5つの通常の水酸化ナトリウムでpHを6.8に調整し、脱イオン水で1リットルに音量を調整します。その後、50グラムの金属キレート樹脂を加え、摂氏4度で24時間磁気攪拌棒を使用して穏やかに攪拌します。
翌日、撹拌を停止し、樹脂を約30分間沈下します。プラスチック製のレシーバで22ミクロンのフィルターユニットを濾過して、残りの樹脂を溶液から殺菌して除去します。今, サプリメントの最小培地を含む 0.5 塩化亜鉛のリットル当たりミリグラム, 40 硫酸マグネシウムのリットル当たり 40 ミリグラム, マンガン硫酸のリットルあたり 0.1 ミリグラム.
ADN濃縮を加えたマイコバクテリアブロス培地の2ミリリットルでMTBの単一コロニーを接種する。摂氏37度で撹拌してインキュベートする。目に見える成長がある場合、培養液を2ミリリットル抽出し、分光光度計上でOD 540を測定する。
OD 540が、対数後期相を示す0.8に達したときにインキュベーションを停止します。0.2グリセロール、0.5%Tween 80、およびADNを加えたマイコバクテリア寒天プレートに対数後期培養200マイクロリットルを広げます。少なくとも5枚のプレートを接種する。
プレートを摂氏37度でインキュベートします。そして1週間後、細菌の増殖はコンフルエント層として見える。その後、低鉄の最小限の媒体で滅菌綿棒を湿まします。
寒天プレートから細菌を収集するために、この綿棒を使用してください。チューブ内の低鉄最小培地の100ミリリットルで細菌を接種します。1のOD 540で懸濁液を調製するのに十分な細菌を集める。
低鉄の最低媒体で懸濁液を10倍から1リットルに希釈し、2つの無菌ペットボトルに分けます。次に、培養物2ミリリットルを5ミリリットル培養管に移す。ボリュームタイロキサポールで10%の体積の10マイクロリットルを追加します。
14日間摂氏37度で培養します。20°Cで7分間2,850回gで5つの225ミリリットル円錐形遠心分離管と遠心分離機に培養を移します。50ミリリットルのピペットで培養上清を収集し、0.22ミクロンのフィルターを通してそれを殺菌するフィルター。
MEVを分離するには、培養液を摂氏4度に置かれた攪拌細胞限外濾過システムに移し、100キロダルトンカットオフ膜を通して50未満のPSIの圧力で濃縮物を濾過する。次に、濃縮培養液を摂氏4度で15分間15分間濾液し、ポリカーボネート超遠心チューブに上清を集める。上清を摂氏4度で2時間100,000倍に遠心する。
その後、上清を取り除き、穏やかなピペット処理によって滅菌PBSの合計1ミリリットルで膜状ペレットを再懸濁する。ポリプロピレン薄壁の超遠心チューブの底に60%iodiキサノール溶液の1.5ミリリットルとペレット懸濁液の0.5ミリリットルを混合します。このMVEイオディアノール45%懸濁液を40%35%30%25%と20%のiodiキサノール溶液と1ミリリットルのPBSを上部に重ね合わせてください。
摂氏4度で18時間100,000倍gの遠心分離機。次に、1ミリリットルのハミルトンシリンジを使用して、上から始まる1ミリリットル密度の勾配分を収集する。各収集した分率をPBSと遠心分離機で20ミリリットルに希釈し、100,000倍gで摂氏4度で2時間希釈します。
上清を取り除き、PBSの0.5ミリリットルで再懸濁します。チューブは摂氏4度で保管してください。膜脂質分析を行うために、各勾配分率の10マイクロリットルを蛍光膜プローブTMA-DPHと組み合わせ、96ウェルブラックプレートの各ウェルにPBSの50マイクロリットルで1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度で結合します。
プレートを摂氏33度で20分間インキュベートします。励起用360ナノメートル、発光用430ナノメートルで蛍光を測定します。このプロトコルでは、MEVは、密度勾配における微分沈下によって精製された。
記載の条件下で、MEVは、25%iodiキサノールに対応する勾配画分3で大部分分離された。ベシクル関連タンパク質は、ドットブロット分析で示した画分3に濃縮した。また、分画3およびナノ粒子分析でMEVの存在を確認した陰性染色は、MEVのサイズが約100ナノメートルであることを示した。
コロニー形成単位に正規化されたタンパク質および脂質濃度は、鉄条件の高さに対して低鉄でのMEV収量の約8倍の増加を示した。ドットブロット分析は、鉄の十分なMTB培養よりも鉄限定MTB培養からの密度勾配画分におけるMEV関連マーカーからのより強いシグナルを示した。鉄の限られた条件を保証し、リポタンパク質凝集体と膜小胞の汚染を防ぐために、最小限の媒体の調製のための指示に従ってください。
この方法で精製されたマイコバクテリア膜小胞は、生化学的特性評価および機能解析に使用することができる。
