该协议利用广泛使用的技术以及可从商业上获得的试剂和工具来评估早期刺激事件期间的内源性 IRF5 激活。它可以很容易地应用于其他细胞环境中的 IRF5 生物学探测。虽然本机 PAGE 是一种广泛使用的技术，但获得清晰、可靠、可解释和可重现的结果在技术上可能具有挑战性。
使用商业运行的缓冲液和凝胶系统有助于最大限度地减少变异性。注重细节是必不可少的，经验是取得好成绩的关键。此修改后的本机 PAGE 协议涉及许多步骤，这些步骤具有成功的关键细节。
视觉演示可以显示这些细节，对研究人员是有益的。在37摄氏度和5%的二氧化碳下，在T75烧瓶中保持CAL-1细胞培养，使用完整的RPMI 1640介质。当准备刺激细胞时，将它们转移到50毫升的圆锥管中，并在200xg下离心5分钟。
去除上一提液，并在介质中重新悬浮颗粒，以获得均匀的单细胞悬浮液。然后用血细胞计对细胞进行说明，并在每井1000个细胞的密度下，在每井中用4毫升预加热介质将细胞播种。孵育细胞20至24小时，使汇合达到90至95%第二天，刺激细胞，通过添加四微升每毫升R848每毫升R848，确保离开控制井与细胞和没有R848治疗。
从一侧到另一侧轻轻摇动板，均匀地分散 R848，然后在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下孵育细胞 2 至 16 小时。孵育后，将细胞悬浮液从板中转移到5毫升离心管中。以200 x g离心细胞5分钟，然后取出上一代，并在PBS的一毫升中重新悬浮颗粒。
将细胞悬浮液转移到1.5毫升管中，在12，000 x g下旋转30至60秒，在4摄氏度下，然后小心地取出上光。根据手稿指示准备解液缓冲液，并放在冰上直到准备好使用。将细胞颗粒重新悬浮在30微升的冰冷解液缓冲液中，并上下移液器混合。
然后在冰上孵化管子15至20分钟。在4摄氏度下，在12，000 x g的离心15至20分钟，将上清液转移到预冷却的1.5毫升管中，确保将提取物随时放在冰上，以澄清酸盐。然后，使用布拉德福德试剂测量蛋白质浓度。
根据手稿指示准备上腔和下腔电泳缓冲液，并用水彻底冲洗 3-12% 原生 PAGE 凝胶，在不扭曲水井的情况下，在处理脱氧钠时应格外小心。处理化学品需要 PPE，用于保护，如实验室外衣、安全护目镜和面罩。然后，将凝胶放入迷你凝胶罐中，取出梳子，添加准备好的上腔和下腔电泳缓冲液，并在 4 摄氏度的冷室或 150 伏的冰上预运行 30 分钟。
同时，通过将冰上细胞蛋白与4X原生样品缓冲液混合，准备样品进行加载。预运行完成后，将 10 至 15 微克蛋白质加载到每个井中，并在 85 伏电压下运行凝胶 30 分钟，然后以 150 伏运行 2 小时。然后，在室温下将凝胶浸泡在 SDS 运行缓冲液中 30 分钟。
将聚乙烯二氟化物膜浸泡在甲醇中约五分钟，以激活膜。在膜的一角进行切割以指示其方向，并按照制造商的协议组装转移三明治。将转接盒放入油箱，以 20 伏特在冰上传输一小时。
然后用塑料钳子从盒式磁带上取下膜，并在室温下在室温下将膜挡在缓冲液中，在摇床上阻塞膜 45 分钟。接下来，在4摄氏度或室温下用原抗体孵育膜两小时，并在摇动时用1XTBST洗涤缓冲液清洗3分钟。然后用二次抗体在室温下使用1XTBST洗涤缓冲液再次孵育膜45分钟，重复洗涤。
然后使用适当的凝胶文档系统扫描印迹。使用此协议，使用R848刺激或未刺激的CAL-1细胞用免疫布洛特进行分析。在未发色的CAL-1细胞中，IRF5被检测为本机 PAGE 上对应于其单体形式的单个波段。
对于受刺激的细胞，IRF5单体水平下降，而二丁体水平增加。在 IRF5 上进行了具有抗 IRF5 抗体的免疫blot，过度表达 293 T 细胞，这些细胞通过各种结构进行转染。未转染的对照中未检测到 IRF5，表明抗 IRF5 抗体的特异性。
仅在293个T细胞中检测到与单体 IRF5 对应的单波段，过度表达 IRF5。当编码ICF5激活蛋白的构造被共同转染时，出现了一个与ICF5的二毛形式对应的缓慢迁移带。然而，NMDA5，一种与RIG-I相关的蛋白质，并没有诱发RF5二丁化。
使用Bis-Tris梯度凝胶至关重要，这可能是由于这种凝胶电泳系统的特定pH值和化学成分，允许分离单体和二毛体形式的RFF5。此外，在非变性原生样品缓冲液中，对细胞的细胞的表达和保存保留了原生蛋白质结构。在这里，我们使用了一种为原生 PAGE 酸定制的商用产品。
另一个大大补充的方法是，利用图像流成像流细胞测量系统来评估RF5核转移，这是在二丁化后在RF5激活中的物质。当我们的协议结合使用时，它用作验证 IRF5 激活中涉及的步骤的另一种测试。IRF5是炎症反应的关键调节器，在感染和免疫、自身免疫性疾病、癌症和许多其他对人类健康重要的疾病中发挥着重要作用。
此外，还努力开发针对 IRF5 和相关转录因子的治疗药物。该协议将允许不同领域的研究人员了解和探索 IRF5 生物学。
