이 프로토콜은 자극의 초기 이벤트 동안 내인성 IRF5 활성화를 평가하기 위해 상업적으로 획득 할 수있는 시약 및 도구와 함께 널리 사용되는 기술을 사용합니다. 그것은 쉽게 다른 세포 맥락에서 IRF5 생물학을 탐구하기 위해 적용될 수 있습니다. 네이티브 PAGE는 널리 사용되는 기술이지만 명확하고 견고하며 해석 가능하며 재현 가능한 결과를 얻는 것은 기술적으로 어려울 수 있습니다.
상용 실행 버퍼 및 젤 시스템을 사용하면 가변성을 최소화할 수 있습니다. 그리고 세부 사항에주의를 기울이는 것이 필수적이며, 경험은 좋은 결과를 얻는 데 성공의 열쇠입니다. 이 수정된 네이티브 PAGE 프로토콜에는 성공의 핵심인 미묘한 세부 정보가 포함된 많은 단계가 포함됩니다.
시각적 데모는 연구자에게 도움이 될 이러한 세부 사항을 보여줄 수 있습니다. 완전한 RPMI 1640 배지로 T75 플라스크에서 37°C와 이산화탄소 5%로 CAL-1 세포 배양을 유지합니다. 세포를 자극할 준비가 되면 50밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 200 x g로 옮긴다.
상체를 제거하고, 균일한 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 매체에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 혈종계를 가진 세포를 설명하고, 각 우물에서 예열 된 매체의 4 밀리리터가있는 6 웰 플레이트에서 잘 당 1, 000, 000 세포의 밀도로 종자. 20~24시간 동안 세포를 배양하여 인플루언서가 90~95%에 도달할 수 있도록 다음 날, 밀리리터 R848당 1밀리그램의 4개의 마이크로리터를 추가하여 세포를 자극하여 세포와 R848 치료 없이 잘 제어할 수 있도록 합니다.
접시를 좌우로 부드럽게 흔들어 R848을 고르게 분산한 다음 세포를 섭씨 37도에서 2~16시간 동안 배양하고 이산화탄소는 5%에 이르는 것으로 나타났다. 인큐베이션 후 플레이트에서 셀 현탁액을 5밀리리터 원심분리튜브로 옮기십시오. 세포를 5분 동안 200 x g로 원심분리한 다음, 상류체를 제거하고 PBS의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
셀 서스펜션을 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30~60초 동안 12, 000 x g로 회전한 다음 상신관을 조심스럽게 제거합니다. 원고 방향에 따라 용해 버퍼를 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 얼음위에 보관하십시오. 얼음 차가운 용해 버퍼의 30 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 파이펫을 위아래로 혼합합니다.
그런 다음 15~20분 동안 얼음에 튜브를 배양합니다. 12, 000 x g에서 15~20분 동안 12~ 000 x g의 원심분리를 명확히 하고, 상체를 1.5밀리리터 튜브로 옮기고, 항상 얼음에 추출물을 보관합니다. 그런 다음, 브래드포드 시약을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
원고 방향에 따라 상부 및 하부 챔버 전기 포근 버퍼를 준비하고, 우물을 왜곡하지 않고 물로 3-12 % 네이티브 PAGE 젤을 완전히 헹구고, 유분을 왜곡하지 않고 데옥시콜레이트 나트륨을 취급할 때 주의해야 한다. 화학 물질 을 취급하기 위해서는 실험실 코트, 안전 고글 및 마스크와 같은 보호를 위해 PPE가 필요합니다. 그런 다음, 미니 젤 탱크에 젤을 설정하고, 빗을 제거하고, 준비된 상부 및 하부 챔버 전기 포진 버퍼를 추가하고, 섭씨 4도 의 차가운 방이나 150 볼트에서 30 분 동안 얼음에 미리 실행합니다.
한편, 4X 네이티브 샘플 버퍼와 얼음에 세포 단백질을 혼합하여 적재시 샘플을 준비한다. 사전 실행이 완료되면 각 웰에 10~ 15 마이크로그램의 단백질을 적재하고 85볼트에서 30분 동안 젤을 실행하고 150볼트에서 2시간 동안 젤을 실행합니다. 그런 다음 실온에서 30 분 동안 SDS 실행 버퍼에 젤을 담그십시오.
약 5분 동안 메탄올에 담그어 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인을 활성화합니다. 멤브레인의 한 모서리에 절단하여 방향을 나타내고 제조업체의 프로토콜에 따라 전송 샌드위치를 조립합니다. 이송 카세트를 탱크에 넣고 얼음 위에 1 시간 동안 20 볼트로 옮습니다.
그런 다음 플라스틱 집게로 카세트에서 멤브레인을 제거하고 흔들 셰이커에서 45 분 동안 실온에서 버퍼를 차단하는 멤브레인을 차단합니다. 다음으로, 1차 항체로 막을 하룻밤 사이에 4도 또는 실온에서 2시간 동안 배양하고 흔들면서 3분 동안 1XTBST 세척 버퍼로 세척합니다. 그런 다음 1XTBST 세척 버퍼를 실온에서 45분 동안 사용하여 이차 항체로 멤브레인을 다시 배양하여 세척을 반복한다.
그런 다음 적절한 젤 문서화 시스템을 사용하여 블롯을 스캔합니다. 이 프로토콜을 사용하여 R848로 자극되거나 자극되지 않은 CAL-1 세포는 면역blot로 분석되었습니다. 자극되지 않은 CAL-1 세포에서 IRF5는 단황 형태에 해당하는 네이티브 PAGE에서 단일 밴드로 검출되었다.
자극된 세포의 경우 IRF5 단조량의 수준이 감소하고 이량의 수준이 증가했습니다. 항 IRF5 항체를 가진 면역블롯은 다양한 구조로 전이된 293T 세포를 과도하게 발현하는 IRF5에서 수행되었다. IRF5가 감염되지 않은 대조군에서 검출되지 않았으며, 항IRF5 항체의 특이성을 입증했다.
단황 IRF5에 대응하는 단일 밴드는 IRF5를 과도하게 발현하는 293 T 세포에서만 검출되었다. IRF5 활성화 단백질을 인코딩하는 분재가 공동 으로 감염되었을 때, IRF5의 희미한 형태에 대응하는 천천히 마이그레이션하는 밴드가 나타났다. 그러나, NMDA5, RIG-I에 관련 단백질, IRF5 이압을 유도 하지 않았다.
Bis-Tris 그라데이션 젤의 사용은 IRF5의 단황 및 조광형태의 분리를 허용한 이 젤 전기전광 시스템의 특정 pH 및 화학 적 조성으로 인해 매우 중요합니다. 또한 비데스팅 네이티브 샘플 버퍼에서 세포 용해를 용해하고 보존하면 토착 단백질 구조를 유지합니다. 여기에서 우리는 네이티브 PAGE 산에 맞게 제공되는 시판되는 것을 사용했습니다.
이를 크게 칭찬하는 추가 방법은, IRF5 핵 전좌를 평가하기 위해 ImageStream 이미징 유동 세포측정 시스템을 활용하는 것입니다. 프로토콜과 결합하면 IRF5 활성화와 관련된 단계를 검증하는 다른 종류의 테스트 역할을 합니다. 염증 반응의 주요 레귤레이터이기 때문에 IRF5는 감염 및 면역, 자가 면역 질환, 암 및 인간의 건강에 중요한 많은 다른 질병에 중요한 역할을합니다.
또한 IRF5 및 관련 전사 요인을 표적으로 하는 치료제 개발에 노력을 기울이고 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 분야의 연구원들이 IRF5 생물학을 이해하고 조사할 수 있도록 합니다.
