Este protocolo utiliza una técnica ampliamente utilizada junto con reactivos y herramientas que se pueden adquirir comercialmente para evaluar la activación endógena de IRF5 durante los primeros eventos de estimulación. Se puede aplicar fácilmente para sondear la biología IRF5 en otro contexto celular. Mientras que PAGE nativo es una técnica ampliamente utilizada, obtener resultados claros, robustos, interpretables y reproducibles puede ser técnicamente difícil.
El uso de un sistema de amortiguación y gel de funcionamiento comercial ayuda a minimizar la variabilidad. Y prestar atención a los detalles es esencial, y la experiencia es clave para el éxito en la obtención de buenos resultados. Este protocolo PAGE nativo modificado implica muchos pasos con detalles sutiles que son clave para el éxito.
La demostración visual puede mostrar estos detalles que serían beneficiosos para los investigadores. Mantenga el cultivo celular CAL-1 en un matraz T75 a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono, con un medio completo rpmI 1640. Cuando esté listo para estimular las células, transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugarlas a 200 x g durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en medio para obtener una suspensión homogénea de una sola célula. Luego cuenta las células con un hemocitometro, y sembrarlas a una densidad de 1.000.000 celdas por pozo en una placa de seis pozos con cuatro mililitros de medio precalentado en cada pozo. Incubar las células durante 20 a 24 horas para permitir que la confluencia llegue a 90 a 95%Al día siguiente, estimular las células mediante la adición de cuatro microlitros de un miligramo por mililitro R848 por pozo, asegurándose de dejar un control bien con las células y sin tratamiento R848.
Mece suavemente la placa de lado a lado para dispersar uniformemente el R848, luego incubar las células durante 2 a 16 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. Después de la incubación, transfiera las suspensiones celulares de la placa a tubos centrífugos de 5 mililitros. Centrifugar las células a 200 x g durante cinco minutos, luego retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS.
Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros y gírela a 12.000 x g durante 30 a 60 segundos a 4 grados centígrados y, a continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante. Prepare el búfer de lelisis de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y manténgalo en hielo hasta que esté listo para usar. Vuelva a suspender el pellet celular en 30 microlitros de tampón de lysis helada, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
Luego incubar el tubo sobre hielo durante 15 a 20 minutos. Aclare el analia centrifugando a 12.000 x g durante 15 a 20 minutos a 4 grados centígrados, y transfiera el sobrenadante a un tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros, asegurándose de mantener los extractos en hielo en todo momento. A continuación, mida la concentración de proteínas con Bradford Reagent.
Preparar los tampones de electroforesis de la cámara superior e inferior de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y enjuagar un gel PAGE 3-12% nativo a fondo con agua, sin distorsionar los pozos Se debe tener especial cuidado al manipular el desoxicolato de sodio. Se requiere EPI para la protección, como la capa de laboratorio, las gafas de seguridad y la máscara, para manipular el producto químico. A continuación, coloca el gel en el Mini Gel Tank, retira el peine, añade los tampones de electroforesis de cámara superior e inferior preparados y pre-ejecutarlo en una sala fría de 4 grados Celsius o en hielo a 150 voltios durante 30 minutos.
Mientras tanto, prepare las muestras para la carga mezclando las proteínas celulares en hielo con 4X Native Sample Buffer. Una vez completada la pre-ejecución, cargue de 10 a 15 microgramos de proteína en cada pozo, y ejecute el gel durante 30 minutos a 85 voltios, seguido de dos horas a 150 voltios. A continuación, remoje el gel en el tampón de funcionamiento SDS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Activar la membrana de difluoruro de polivinilideno empapándola en metanol durante aproximadamente cinco minutos. Haga un corte en una esquina de la membrana para indicar su orientación, y montar el sándwich de transferencia de acuerdo con el protocolo del fabricante. Coloque el cassette de transferencia en el tanque y transfiera a 20 voltios durante una hora sobre hielo.
A continuación, retire la membrana del cassette con fórceps de plástico y bloquee la membrana en el tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 45 minutos en una coctelera mecedora. A continuación, incubar la membrana con el anticuerpo primario a 4 grados centígrados durante la noche o a temperatura ambiente durante dos horas y lavarla con un tampón de lavado 1XTBST durante tres minutos mientras se balancea. A continuación, incubar la membrana con el anticuerpo secundario de nuevo utilizando el tampón de lavado 1XTBST a temperatura ambiente durante 45 minutos, repitiendo los lavados.
A continuación, escanee la mancha utilizando un sistema de documentación de gel adecuado. Usando este protocolo, las células CAL-1 que fueron estimuladas o no estimuladas con R848 fueron analizadas con un inmunoblot. En las células CAL-1 no estimuladas, IRF5 se detectó como una sola banda en la pagina nativa correspondiente a su forma monomérica.
Para las células estimuladas, el nivel de monómero IRF5 disminuyó, mientras que el nivel del dimer aumentó. Se realizó un inmunoblot con anticuerpo anti-IRF5 en IRF5 sobre-expresando 293 células T transfectadas con varias construcciones. No se detectó IRF5 en el control no infectado, lo que demuestra la especificidad del anticuerpo anti-IRF5.
Una sola banda correspondiente al IRF5 monomérico sólo se detectó en las 293 células T que sobre-expresan IRF5. Cuando las construcciones que codifican las proteínas activadores IRF5 fueron co-transfectados, apareció una banda de migración lenta correspondiente a la forma dimerica de IRF5. Sin embargo, NMDA5, una proteína relacionada con RIG-I, no indujo dimerización IRF5.
El uso de geles de gradiente Bis-Tris es crucial, probablemente debido al pH específico y la composición química de este gel de sistemas electroforéticos que permitieron la separación de las formas monoméricas y dimericas de IRF5. Además, el alizado y la preservación de los litos celulares en el tampón de muestra nativo no desnaturalizado retiene las estructuras de proteínas nativas. Aquí utilizamos uno disponible comercialmente que está diseñado para ácidos PAGE nativos.
Un método adicional que se complementa en gran medida con esto es utilizar el sistema de citometría de flujo de imágenes ImageStream para evaluar la translocación nuclear IRF5, que es la sustancia que en la activación de IRF5 después de la dimerización. Cuando se combina con nuestro protocolo, sirve como otro tipo de prueba para validar los pasos involucrados en la activación de IRF5. Siendo un regulador clave de la respuesta inflamatoria, IRF5 desempeña un papel importante en la infección y la inmunidad, enfermedades autoinmunes, cáncer, y muchas otras enfermedades importantes para la salud humana.
También hay esfuerzos en el desarrollo de terapias para dirigirse a IRF5 y factores de transcripción relacionados. Este protocolo permitirá a los investigadores de diversos campos comprender y sondear la biología IRF5.
