Questo protocollo utilizza una tecnica ampiamente utilizzata insieme a reagenti e strumenti che possono essere acquisiti commercialmente per valutare l'attivazione endogena di IRF5 durante i primi eventi di stimolazione. Può essere facilmente applicato per sondare la biologia IRF5 in altri contesti cellulari. Mentre la PAGE nativa è una tecnica ampiamente utilizzata, ottenere risultati chiari, robusti, interpretabili e riproducibili può essere tecnicamente impegnativo.
L'utilizzo di un buffer di funzionamento commerciale e di un sistema gel aiuta a ridurre al minimo la variabilità. E prestare attenzione ai dettagli è essenziale e l'esperienza è la chiave del successo nell'ottenere buoni risultati. Questo protocollo PAGE nativo modificato comporta molti passaggi con dettagli sottili che sono fondamentali per il successo.
La dimostrazione visiva può mostrare questi dettagli che sarebbero utili per i ricercatori. Mantenere la coltura cellulare CAL-1 in un pallone T75 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, con mezzo RPMI 1640 completo. Quando sei pronto a stimolare le cellule, trasferiscile in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugale a 200 x g per cinque minuti.
Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in mezzo per ottenere una sospensione omogenea a singola cella. Quindi tenere conto delle cellule con un emocitometro, e seminarle ad una densità di 1.000.000 di cellule per pozzo in una piastra a sei pozzi con quattro millilitri di mezzo preriscaldato in ogni pozzo. Incubare le cellule per 20-24 ore per consentire alla confluenza di raggiungere il 90-95%Il giorno successivo, stimolare le cellule aggiungendo quattro microlitri di un milligrammo per millilitro R848 per pozzo, assicurandosi di lasciare un controllo bene con le cellule e nessun trattamento R848.
Scuotere delicatamente la piastra da un lato all'altro per disperdere uniformemente l'R848, quindi incubare le cellule per 2-16 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, trasferire le sospensioni cellulari dalla piastra in tubi di centrifuga da 5 millilitri. Centrifugare le cellule a 200 x g per cinque minuti, quindi rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri e farlo girare verso il basso a 12.000 x g per 30-60 secondi a 4 gradi Celsius, quindi rimuovere con cura il supernatante. Preparare il tampone di lisi secondo le indicazioni del manoscritto e tenerlo sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso. Sospendere di nuovo il pellet cellulare in 30 microlitri di tampone di lysis ghiacciato e pipettare su e giù per mescolare.
Quindi incubare il tubo sul ghiaccio per 15-20 minuti. Chiarire il litolato centrifugando a 12.000 x g per 15-20 minuti a 4 gradi Celsius e trasferire il supernatante in un tubo pre-refrigerato da 1,5 millilitri, assicurandosi di mantenere gli estratti sul ghiaccio in ogni momento. Quindi, misurare la concentrazione proteica usando Bradford Reagent.
Preparare i tamponi di elettroforesi a camera superiore e inferiore secondo le indicazioni del manoscritto e sciacquare accuratamente con acqua un gel PAGE nativo del 3-12%, senza distorcere i pozzi Prestare particolare attenzione quando si maneggia il deossicholato di sodio. I DPI per la protezione come camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e maschera sono necessari per la manipolazione della sostanza chimica. Quindi, impostare il gel nel Mini Gel Tank, rimuovere il pettine, aggiungere i tamponi di elettroforesi a camera superiore e inferiore preparati e pre-eseguito in una cella frigorifera di 4 gradi Celsius o sul ghiaccio a 150 volt per 30 minuti.
Nel frattempo, preparare i campioni per il caricamento mescolando le proteine cellulari sul ghiaccio con 4X Native Sample Buffer. Una volta completata la pre-corsa, caricare da 10 a 15 microgrammi di proteine ad ogni pozzo e far funzionare il gel per 30 minuti a 85 volt, seguito da due ore a 150 volt. Quindi, immergere il gel nel tampone di corsa SDS per 30 minuti a temperatura ambiente.
Attivare la membrana difluoruro di polivinilidene immergendola in metanolo per circa cinque minuti. Effettuare un taglio su un angolo della membrana per indicare il suo orientamento e assemblare il sandwich di trasferimento secondo il protocollo del produttore. Posizionare la cassetta di trasferimento nel serbatoio e trasferire a 20 volt per un'ora sul ghiaccio.
Quindi rimuovere la membrana dalla cassetta con le forcep di plastica e bloccare la membrana nel tampone di blocco a temperatura ambiente per 45 minuti su uno shaker a dondolo. Successivamente, incubare la membrana con l'anticorpo primario a 4 gradi Celsius durante la notte o a temperatura ambiente per due ore e lavarla con tampone di lavaggio 1XTBST per tre minuti durante il dondolo. Quindi incubare nuovamente la membrana con l'anticorpo secondario utilizzando il tampone di lavaggio 1XTBST a temperatura ambiente per 45 minuti, ripetendo i lavaggi.
Quindi scansionare la macchia utilizzando un adeguato sistema di documentazione del gel. Utilizzando questo protocollo, le cellule CAL-1 che sono state stimolate o non stimolate con R848 sono state analizzate con un immunoblot. Nelle celle CAL-1 non stimolate, IRF5 è stato rilevato come una singola banda nella PAGE nativa corrispondente alla sua forma monomerica.
Per le cellule stimolate, il livello di monomero IRF5 è diminuito, mentre il livello del dimero è aumentato. Un'immunoblot con anticorpo anti-IRF5 è stata eseguita su cellule IRF5 che esprimono 293 cellule T trasfetate con vari costrutti. Nessun IRF5 è stato rilevato nel controllo non trasfetto, dimostrando la specificità dell'anticorpo anti-IRF5.
Una singola banda corrispondente all'IRF5 monomerico è stata rilevata solo nelle 293 cellule T che esprimono troppo IRF5. Quando i costrutti che codificano le proteine attivanti IRF5 sono stati co-trasfetati, è apparsa una banda che migra lentamente corrispondente alla forma dimerica di IRF5. Tuttavia, NMDA5, una proteina correlata a RIG-I, non ha indotto la dimerizzazione IRF5.
L'uso di gel gradiente Bis-Tris è cruciale, probabilmente a causa del pH specifico e della composizione chimica di questo gel sistemi elettroforetici che hanno permesso la separazione di forme monomeriche e dimeriche di IRF5. Inoltre, la llysing e la conservazione dei llysati cellulari nel tampone di campioni nativi non denaturanti conservano le strutture proteiche native. Qui ne abbiamo usato uno disponibile in commercio su misura per gli acidi PAGE nativi.
Un metodo aggiuntivo che si complimenta molto con questo è quello di utilizzare il sistema di citometria del flusso di imaging ImageStream per valutare la traslocazione nucleare IRF5, che è la sostanza che nell'attivazione IRF5 dopo la dimerizzazione. Se combinato con il nostro protocollo, funge da altro tipo di test per convalidare i passaggi coinvolti nell'attivazione IRF5. Essendo un regolatore chiave della risposta infiammatoria, IRF5 svolge un ruolo importante nell'infezione e nell'immunità, nelle malattie autoimmuni, nel cancro e in molte altre malattie importanti per la salute umana.
Ci sono anche sforzi nello sviluppo di terapie per indirizzare l'IRF5 e i relativi fattori di trascrizione. Questo protocollo consentirà ai ricercatori di diversi campi di comprendere e sondare la biologia IRF5.
