Этот протокол использует широко используемый метод наряду с реагентами и инструментами, которые могут быть приобретены на коммерческой основе для оценки эндогенной активации IRF5 во время ранних событий стимуляции. Он может быть легко применен для зондирования биологии IRF5 в другом клеточном контексте. В то время как родной PAGE является широко используемым методом, получение четких, надежных, интерпретируемых и воспроизводимых результатов может быть технически сложным.
Использование коммерческой системы буфера и геля помогает свести к минимуму изменчивость. И обращая внимание на детали имеет важное значение, и опыт является ключом к успеху в получении хороших результатов. Этот модифицированный родной протокол PAGE включает в себя множество шагов с тонкими деталями, которые являются ключом к успеху.
Визуальная демонстрация может показать эти детали, которые были бы полезны для исследователей. Поддерживайте культуру клеток CAL-1 в колбе T75 при 37 градусах Цельсия и 5%углеродном диоксиде, с полным RPMI 1640 среды. Когда готовы стимулировать клетки, передать их в 50-миллилитровую коническую трубку и центрифуги их на 200 х г в течение пяти минут.
Удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в среде, чтобы получить однородную одноклеточную подвеску. Затем с учетом клеток с гемоцитометром, и семена их при плотности 1000000 клеток на колодец в шесть хорошо пластины с четырьмя миллилитров предварительно нагретой среды в каждой хорошо. Инкубировать клетки в течение 20 до 24 часов, чтобы позволить слиянию достичь 90 до 95%На следующий день, стимулировать клетки, добавив четыре микролитера один миллиграмм на миллилитр R848 на колодец, убедившись, что оставить контроль хорошо с клетками и не R848 лечения.
Аккуратно раскачивайте пластину из стороны в сторону, чтобы равномерно разогнать R848, затем инкубировать клетки в течение 2 до 16 часов при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. После инкубации перенесите клеточные суспензии с пластины в 5-миллилитровые центрифуги. Центрифуга клетки на 200 х г в течение пяти минут, затем удалить супернатант, и повторно приостановить гранулы в один миллилитр PBS.
Перенесите подвеску клетки в 1,5-миллилитровую трубку и вращайте ее при 12 000 х г в течение 30-60 секунд при 4 градусах Цельсия, затем аккуратно удалите супернатант. Подготовь буфер лиза в соответствии с рукописными указаниями и держите его на льду до готовности к использованию. Повторно приостановить ячейки гранулы в 30-микролитров ледяной лиза буфера, и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать.
Затем инкубировать трубку на льду в течение 15 до 20 минут. Уточните лизат путем центрифугирования при 12 000 х г в течение 15-20 минут при 4 градусах цельсия и перенесите супернатант в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку, убедившись, что экстракты всегда будут храниться на льду. Затем измерьте концентрацию белка с помощью Брэдфордского реагента.
Подготовка верхней и нижней камеры электрофорез буферов в соответствии с рукописными направлениями, и промыть 3-12%родной ГЕЛЬ PAGE тщательно с водой, без искажения скважин Дополнительная осторожность должна быть приняты при обработке деоксихолата натрия. PPE для защиты, таких как лабораторное пальто, защитные очки и маска, необходимы для обработки химического вещества. Затем установите гель в мини-гель танк, удалить гребень, добавить подготовленные верхней и нижней камеры электрофорез буферов, и предварительно запустить его в 4 градуса по Цельсию холодной комнате или на льду на 150 вольт в течение 30 минут.
Между тем, подготовить образцы для загрузки путем смешивания клеточных белков на льду с 4X Родной образец буфера. После завершения предварительного запуска загрузите от 10 до 15 микрограммов белка на каждую колодец и запустите гель в течение 30 минут при 85 вольтах, а затем два часа при 150 вольтах. Затем замочите гель в SDS работает буфер в течение 30 минут при комнатной температуре.
Активируйте мембрану дифторида поливинилида, замачивая ее в метаноле в течение примерно пяти минут. Сделайте разрез на одном углу мембраны, чтобы указать ее ориентацию, и соберите сэндвич с передачей в соответствии с протоколом производителя. Поместите кассету передачи в бак и перенесите на 20 вольт в течение одного часа на лед.
Затем снимите мембрану с кассеты с помощью пластиковых типсов и блокируйте мембрану в блокируя буфер при комнатной температуре в течение 45 минут на качалке. Далее, инкубировать мембрану с первичным антителом при температуре 4 градусов по Цельсию на ночь или при комнатной температуре в течение двух часов и мыть его с 1XTBST стиральный буфер в течение трех минут во время качания. Затем инкубировать мембрану со вторичным антителом снова с помощью 1XTBST стиральный буфер при комнатной температуре в течение 45 минут, повторяя моет.
Затем просканировать пятно с помощью соответствующей системы документации гель. Используя этот протокол, клетки CAL-1, которые были либо стимулированы или unstimulated с R848 были проанализированы с иммуноблотом. В нестимулированных клетках CAL-1 IRF5 был обнаружен как единая полоса на родном PAGE, соответствующая ее мономерной форме.
Для стимулируемых клеток уровень мономера IRF5 снизился, в то время как уровень димера повысился. Иммунобло с антителами анти-IRF5 был выполнен на IRF5 чрезмерного выражения 293 Т-клеток, трансфицированных с различными конструкциями. В нетрансфицированном контроле IRF5 не было обнаружено IRF5, демонстрирующее специфичность антитела к IRF5.
Одна полоса, соответствующая мономерной IRF5, была обнаружена только в 293 Т-клетках, чрезмерно выражаюх IRF5. Когда конструкции, кодирующие активированные белки IRF5, были совместно трансфицированы, появилась медленно мигрирующей полоса, соответствующая димерикической форме IRF5. Тем не менее, NMDA5, связанный с RIG-I, не вызывал iRF5 димеризации.
Использование гель-градиентов Bis-Tris имеет решающее значение, вероятно, из-за специфического рН и химического состава этого геля электрофоретических систем, что позволило разделение мономерных и димерикических форм IRF5. Кроме того, лизирование и сохранение лизатов клеток в не-денатурации родной буфер образца сохраняет родные структуры белка. Здесь мы использовали коммерчески доступный, который предназначен для местных кислот PAGE.
Дополнительным методом, который в значительной степени дополняет это, является использование системы цитометрии потока изображений ImageStream для оценки ядерной транслокации IRF5, которая является веществом, которое в активации IRF5 после димеризации. В сочетании с нашим протоколом, он служит в качестве другого вида теста для проверки шагов, участвующих в активации IRF5. Будучи ключевым регулятором воспалительной реакции, IRF5 играет важную роль в инфекции и иммунитете, аутоиммунных заболеваниях, раке и многих других заболеваниях, важных для здоровья человека.
Существуют также усилия по разработке терапевтических средств для целевой IRF5 и связанных с ними факторов транскрипции. Этот протокол позволит исследователям в различных областях понять и исследовать биологию IRF5.
