このプロトコルは、刺激の初期のイベント中に内因性IRF5活性化を評価するために商業的に取得することができる試薬およびツールと一緒に広く使用されている技術を利用する。他の細胞コンテキストでIRF5生物学を調査するために簡単に適用することができます。ネイティブ PAGE は広く使用されている手法ですが、明確で堅牢で、解釈可能で再現可能な結果を得ることは技術的に困難です。
市販のランニングバッファとゲルシステムを使用すると、変動を最小限に抑えることができます。そして細部に注意を払うことが不可欠であり、経験は良い結果を得るために成功するための鍵です。この変更されたネイティブ PAGE プロトコルには、成功の鍵となる細かな詳細を含む多くのステップが含まれます。
視覚的なデモンストレーションは、研究者にとって有益であろうこれらの詳細を示すことができます。完全なRPMI 1640培地で、T75フラスコで37°C、炭酸ガス5%でCAL-1細胞培養を維持します。細胞を刺激する準備ができたら、50ミリリットルの円錐管に移し、200 x gで5分間遠心分離します。
上清を取り除き、ペレットを培地に再懸濁させて均質な単細胞懸濁液を得た。その後、ヘモサイトメーターで細胞を説明し、各ウェルに4ミリリットルの予熱媒体を備えた6ウェルプレートに1ウェルあたり1,000,000個の密度で播種します。翌日、合流度が90〜95%に達するために20〜24時間培養し、1ミリリットル当たり1ミリグラムの4マイクロリットルをウェルあたり1ミリグラムの4マイクロリットルを添加して細胞を刺激し、細胞とR848治療を受けずにコントロールを十分に残すことを確認する。
プレートを左右に軽く揺らし、R848を均等に分散させ、摂氏37度と炭酸ガス5%で2~16時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートから5ミリリットルの遠心分離チューブに細胞懸濁液を移します。細胞を200xgで5分間遠心し、その後上清を取り除き、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。
セル懸濁液を1.5ミリリットルチューブに移し、摂氏4度で30〜60秒間12,000 x gでスピンダウンし、上清を慎重に取り除きます。原稿の指示に従ってリシスバッファーを準備し、使用する準備ができるまで氷の上に保管します。細胞ペレットを氷冷リシスバッファーの30マイクロリットルに再懸濁し、ピペットを上下に混合します。
その後、氷の上にチューブを15〜20分間インキュベートします。摂氏4度で12,000xgで15〜20分間遠心分離機でライセートを明確にし、上清を冷やした1.5ミリリットルチューブに移し、常に氷の上に抽出物を保持します。次に、ブラッドフォード試薬を用いてタンパク質濃度を測定する。
原稿の指示に従って上下の室内電気泳動バッファーを準備し、3〜12%天然PAGEゲルを水で十分に洗い流し、井戸を歪めることなく、デオキシコール酸ナトリウムを取り扱う際に特別な注意を払う必要があります。薬品の取り扱いには、ラボコート、安全ゴーグル、マスクなどの保護用PPEが必要です。その後、ゲルをミニゲルタンクにセットし、くしを取り除き、準備した上下室内電気泳動バッファーを追加し、摂氏4度の冷たい部屋または氷の上で30分間事前に実行します。
一方、氷上の細胞タンパク質を4Xネイティブサンプルバッファーと混合して、サンプルをロードできるように準備します。プレランが完了したら、各ウェルに10〜15マイクログラムのタンパク質をロードし、85ボルトで30分間ゲルを実行し、続いて150ボルトで2時間実行します。次に、ゲルをSDS走行バッファーに室温で30分間浸します。
ポリビニリデンジフルオリド膜をメタノールに約5分間浸して活性化します。膜の片隅に切り取って向きを示し、製造業者のプロトコルに従って転写サンドイッチを組み立てます。転写カセットをタンクに入れ、氷の上で1時間20ボルトで移します。
その後、プラスチック製鉗子でカセットから膜を取り出し、ロッキングシェーカーで45分間室温でブロッキングバッファ内の膜をブロックします。次に、一次抗体を摂氏4度または室温で2時間インキュベートし、揺れながら1XTBST洗浄バッファーで3分間洗浄します。次に、室温で1XTBST洗浄バッファーを使用して再び二次抗体で膜をインキュベートし、洗浄を繰り返す。
次に、適切なゲルドキュメンテーションシステムを使用してブロットをスキャンします。このプロトコルを用いて、R848で刺激または非刺激を受けたCAL-1細胞を免疫ブロットで分析した。非刺激型CAL-1細胞において、IRF5は、その単量体形態に対応するネイティブPAGE上で単一のバンドとして検出された。
刺激を受けた細胞の場合、IRF5モノマーのレベルは低下し、一方でダイマーのレベルは増加した。抗IRF5抗体を有するイムノブロットを、様々な構成体にトランスフェクトした293T細胞を過剰発現させるIRF5上で行った。未感染制御ではIRF5は検出されず、抗IRF5抗体の特異性を示した。
単量体IRF5に対応する単一のバンドは、IRF5を過剰発現する293 T細胞でのみ検出された。IRF5活性化タンパク質をコードする構築物が共入化した際に、IRF5の二量体形態に対応するゆっくりと移動するバンドが現れた。しかし、I-Iに関連するタンパク質であるNMDA5は、IRF5二量体化を誘導しなかった。
Bis-Trisの勾配ゲルの使用は、IRF5の単量体および二量体形態の分離を可能にしたこのゲル電気泳動系の特定のpHおよび化学組成のために、非常に重要である。また、非変性天然サンプルバッファー内の細胞ライセートをリジングおよび保存することは、天然のタンパク質構造を保持します。ここでは、ネイティブのPAGE酸に合わせた市販のものを使用しました。
これと大いに補完する追加の方法は、ImageStreamイメージングフローサイトメトリーシステムを利用してIRF5核転座を評価する、二量体化後のIRF5活性化中の物質である。プロトコルと組み合わせると、IRF5のアクティベーションに関連するステップを検証する他の種類のテストとして機能します。炎症反応の重要な調節因子であるIRF5は、感染および免疫、自己免疫疾患、癌、および人間の健康にとって重要な他の多くの疾患において重要な役割を果たしている。
IRF5および関連する転写因子を標的とする治療薬の開発にも取り組みがあります。このプロトコルは、多様な分野の研究者がIRF5生物学を理解し、調査することを可能にします。
