Ce protocole utilise une technique largement utilisée avec des reagents et des outils qui peuvent être acquis commercialement pour évaluer l’activation endogène d’IRF5 pendant les premiers événements de stimulation. Il peut facilement être appliqué pour sonder la biologie IRF5 dans d’autres contextes cellulaires. Bien que page natif soit une technique largement utilisée, l’obtention de résultats clairs, robustes, interprétables et reproductibles peut être techniquement difficile.
L’utilisation d’un tampon commercial et d’un système de gel contribue à minimiser la variabilité. Et prêter attention aux détails est essentiel, et l’expérience est la clé du succès dans l’obtention de bons résultats. Ce protocole PAGE natif modifié comporte de nombreuses étapes avec des détails subtils qui sont la clé du succès.
La démonstration visuelle peut montrer ces détails qui seraient bénéfiques pour les chercheurs. Maintenir la culture cellulaire cal-1 dans un flacon T75 à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, avec rpmi complet 1640 milieu. Lorsqu’ils sont prêts à stimuler les cellules, transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez-les à 200 x g pendant cinq minutes.
Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille à moyen pour obtenir une suspension homogène à cellule unique. Ensuite, comptez les cellules avec un hémocytomètre, et les ensemencer à une densité de 1000 000 cellules par puits dans une plaque de six puits avec quatre millilitres de milieu préchauffé dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 20 à 24 heures pour permettre à la confluence d’atteindre 90 à 95% Le lendemain, stimuler les cellules en ajoutant quatre microlitres d’un milligramme par millilitre R848 par puits, en s’assurant de laisser un puits de contrôle avec les cellules et pas de traitement R848.
Bercer doucement la plaque d’un côté à l’autre pour disperser uniformément le R848, puis incuber les cellules pendant 2 à 16 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après l’incubation, transférer les suspensions cellulaires de la plaque en tubes de centrifugeuse de 5 millilitres. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant cinq minutes, puis retirer le supernatant, et re-suspendre la pastille dans un millilitre de PBS.
Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre et la faire tourner à 12 000 x g pendant 30 à 60 secondes à 4 degrés Celsius, puis retirer soigneusement le surnatant. Préparez le tampon de lyse selon les instructions manuscrites et gardez-le sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 30 microlitres de tampon de lyse glacée, et pipette de haut en bas pour mélanger.
Ensuite, incuber le tube sur la glace pendant 15 à 20 minutes. Clarifier le lysate en centrifugant à 12 000 x g pendant 15 à 20 minutes à 4 degrés Celsius, et transférer le supernatant dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre, en s’assurant de garder les extraits sur la glace en tout temps. Ensuite, mesurez la concentration en protéines à l’aide de Bradford Reagent.
Préparer les tampons d’électrophoresis de chambre supérieure et inférieure selon les instructions manuscrites, et rincer soigneusement un gel PAGE 3-12% indigène avec de l’eau, sans déformer les puits Un soin supplémentaire doit être pris lors de la manipulation du désoxycholate de sodium. Des EPI pour la protection telles que le manteau de laboratoire, les lunettes de sécurité, et le masque sont exigés pour manipuler le produit chimique. Ensuite, placez le gel dans le mini réservoir de gel, retirez le peigne, ajoutez les tampons préparés d’électrophoresis de chambre supérieure et inférieure, et pré-exécutez-le dans une pièce froide de 4 degrés Celsius ou sur la glace à 150 volts pendant 30 minutes.
Pendant ce temps, préparer les échantillons pour le chargement en mélangeant les protéines cellulaires sur la glace avec 4X Tampon échantillon indigène. Une fois la pré-course terminée, chargez 10 à 15 microgrammes de protéines à chaque puits et exécutez le gel pendant 30 minutes à 85 volts, suivi de deux heures à 150 volts. Ensuite, tremper le gel dans le tampon de fonctionnement SDS pendant 30 minutes à température ambiante.
Activez la membrane de difluoride polyvinylidene en la trempant dans du méthanol pendant environ cinq minutes. Faire une coupe sur un coin de la membrane pour indiquer son orientation, et assembler le sandwich de transfert selon le protocole du fabricant. Placer la cassette de transfert dans le réservoir et transférer à 20 volts pendant une heure sur la glace.
Retirez ensuite la membrane de la cassette avec des forceps en plastique et bloquez la membrane en bloquant le tampon à température ambiante pendant 45 minutes sur un shaker à bascule. Ensuite, incubez la membrane avec l’anticorps primaire à 4 degrés Celsius pendant la nuit ou à température ambiante pendant deux heures et lavez-la avec un tampon de lavage 1XTBST pendant trois minutes pendant le basculement. Puis incuber la membrane avec l’anticorps secondaire à nouveau en utilisant le tampon de lavage 1XTBST à température ambiante pendant 45 minutes, en répétant les lavages.
Puis numérisez la tache à l’aide d’un système de documentation de gel approprié. En utilisant ce protocole, les cellules CAL-1 qui ont été stimulées ou non stimulées avec R848 ont été analysées avec un immunoblot. Dans les cellules CAL-1 non simulées, IRF5 a été détecté comme une seule bande sur la PAGE indigène correspondant à sa forme monomère.
Pour les cellules stimulées, le niveau de monomère IRF5 a diminué, tandis que le niveau du dimère a augmenté. Un immunoblot avec l’anticorps anti-IRF5 a été exécuté sur IRF5 sur-exprimant 293 cellules de T transfected avec diverses constructions. Aucun IRF5 n’a été détecté dans le contrôle non transmis, démontrant la spécificité de l’anticorps anti-IRF5.
Une seule bande correspondant à l’IRF5 monomère n’a été détectée que dans les 293 cellules T sur-exprimant IRF5. Lorsque les constructions codant les protéines activateurs IRF5 ont été co-transfectées, une bande migrante lentement correspondant à la forme dimérique d’IRF5 est apparue. Cependant, NMDA5, une protéine apparenté à RIG-I, n’a pas induit la dimémissement d’IRF5.
L’utilisation de gels de gradient Bis-Tris est cruciale, probablement en raison du pH spécifique et de la composition chimique de ce gel électrophoretic systèmes qui ont permis la séparation des formes monomères et dimériques de l’IRF5. De plus, le lysage et la préservation des lysates cellulaires dans le tampon d’échantillons indigènes non dénaturant conservent les structures protéiques indigènes. Ici, nous avons utilisé un disponible dans le commerce qui est adapté pour les acides PAGE natifs.
Une méthode supplémentaire qui complète grandement avec cela est, est d’utiliser le système de cytométrie de flux d’imagerie ImageStream pour évaluer la translocation nucléaire IRF5, qui est la substance que dans l’activation IRF5 après dimétisation. Lorsqu’il est combiné avec notre protocole, il sert d’autre type de test pour valider les étapes impliquées dans l’activation IRF5. Étant un régulateur clé de la réponse inflammatoire, IRF5 joue un rôle important dans l’infection et l’immunité, les maladies auto-immunes, le cancer et de nombreuses autres maladies importantes pour la santé humaine.
Il ya aussi des efforts dans le développement de thérapeutiques pour cibler IRF5 et les facteurs de transcription connexes. Ce protocole permettra aux chercheurs de divers domaines de comprendre et de sonder la biologie de l’IRF5.
