小殖民地变种或SCV技术允许选择和生长小殖民地变种的伪多多尼亚亚鲁吉诺萨。该方法非常明确，允许比正常方法更容易选择。与标准尿酸卡巴佐尔法相比，该协议还详细说明了一种更安全、更敏感的 ELISA 扩增方法，使样品中的直接藻酸盐定量无需烧灼或样品操作。
展示这个程序的将是实验室技术员布兰登·柯比和来自我实验室的研究生罗伊·阿尔·阿赫马尔。要检测小菌落变种或SCV，首先在预热PIA板上条纹P.aeruginosa应变PAO1三角洲PYD。在37摄氏度下种植菌株48小时。
在生长板上，识别具有 SCV 表型的单一菌落分离物，其特征为一到三毫米的菌落大小，而不是正常的三到五毫米菌群大小。重新条纹所选菌落，以获得 SCV 的纯隔离。要对抢救途径进行生理激活，请使用无菌接种回路从PIA板中选取SCV菌落。
在预热的 PIA 板上条纹选定的菌落，并辅以 0.1 毫摩尔化。在37摄氏度下将板生长24至48小时。要开始尿酸卡巴佐尔测定，从所需的菌株的纯培养中识别单个菌落，并使用无菌牙签挑选菌落。
将牙签放在含有五毫升 PIB 的培养试管中。在37摄氏度的摇床孵化器中生长24小时。孵育后，在预热的PIA板上加入一个培养的PIB汤。
使用无菌细胞扩散器，将汤在盘子上扩散，并在37摄氏度下生长24小时。使用移液器控制器和无菌 50 毫升移液器，在成人草坪上加入 0.85% 氯化钠，并使用细胞扩散器刮板收集样品。使用新鲜 50 毫升移液器吸气样品，并转移到 50 毫升收集管中。
将样品高旋转，将样品混合并放在冰上。要测量样品的OD600，首先使用一毫升0.85%氯化钠将分光光度计空白。然后将样品的一毫升添加到新的一次性蛋黄酱中，然后读取 OD。重复此步骤两次，以获得每个样本的读取量三倍。
现在，将三毫升硫酸玻酸玻酸溶液加入培养管，让坐冰上。将收集的样品中的350微升缓慢地加入试管中的酸性混合物中。在低度上短暂涡旋后，在酸样品混合物中加入100微升0.1%的卡巴佐和乙醇溶液。
将管子和涡流盖住介质设置五秒钟。然后在55摄氏度的干浴中放置30分钟。孵育后，将管子短暂地旋转到高位，冷却五分钟。
使用含有 0.85% 氯化钠的管作为分光光度计的空白。然后将一毫升混合物加入一个干净的库子中，并在分光光度计上读取530纳米样品的OD。通过测量已知浓度 d-曼努尼酸的连续稀释的 OD530 来准备标准曲线。
重复两次，并从这些读数中提取线性方程。使用标准曲线计算每个样品中藻酸盐的浓度，将藻酸盐浓度从线性方程中除以OD600，以获得每OD600的藻酸盐总量。使用微管，将收集的样品的 50 微升添加到未经处理的 96 井板中。
然后向油井中加入 50 微升 ELISA 涂层缓冲液。在37摄氏度下孵育板两小时。使用喷瓶，用 PBS-T 将板井用 PBS-T 洗涤两次，然后将板翻过来排干。
在井中加入200微升的阻尼缓冲液，用微管在4摄氏度下孵育。第二天，用PBS-T和以前一样洗盘子两次。然后向井中加入100微升稀释原抗体，在37摄氏度下孵育一至两个小时。
孵育后，与以前一样用PBS-T清洗板井三次。接下来，在井中加入100微升稀释的二次抗体，在37摄氏度下孵育一至两个小时。再次清洗板三次后，使用微管添加 100 微升 TMB ELISA 溶液。
将板放入抽屉或用铝箔包裹，在室温下孵育板30分钟。然后添加 100 微升停止解决方案。使用板读卡器在 450 纳米时测量 OD。
通过测量已知浓度 d-曼努尼酸的连续稀释的 OD450 来生成标准曲线。重复测量两次并提取线性方程。使用标准曲线计算每个样品中的藻酸盐浓度，将藻酸盐浓度从线性方程中除以 OD600，以获得每 OD600 的藻酸盐总量。
此处显示的有PAO581和PAO581的样本，这些样本具有在PIA和PIA上生长的调节苯丙胺新生物合成基因突变，并辅以0.1毫摩尔的尿素。数据显示，介质中存在尿酸会导致突变菌株转换回粘膜，如恢复的藻酸盐生产所见。在这里，显示了抗藻酸盐单克隆抗体为基础的ELISA的结果。
菌落生长在PIA板上，用阿拉伯糖诱导PBAD启动子和PHERD-20T质粒。图中所示为PAO1、PAO1携带表达质粒pHERD-20T，主要藻酸盐特异性西格玛因子algU，PAO1带algD基因在帧内删除，编码关键藻酸盐生物合成酶GDP-曼诺异质酶。这些数据比较了PAO1和PAO1三角洲algD测量的非粘液水平与PAO1用pHERD-20T algU测量的藻酸盐的粘液水平。
抗藻酸盐ELISA也在患者痰样上进行了测试，没有在板上生长。三个具有粘液P.aeruginosa生长的CF痰样显示可检测的藻酸盐相比，两个患者痰样本，要么含有非粘液P.aeruginosa或没有P.aeruginosa生长。为藻酸盐定量准备标准曲线非常重要，因为这样可以精确准确地测量样品中的藻酸盐。
卡巴佐尔方法中使用的酸溶液非常危险，因此必须使用适当的个人防护设备和预防措施来确保安全。隔离SCV后，可以进行进一步的基因分析，以更好地了解发生突变的发生和与此类突变相关的致病性。ELISA 方法可用于监测囊性纤维化患者的慢性肺部感染。
此外，我们的生长方法可以帮助诊断由特定SCV引起的感染。
