La variante de petite colonie ou technique SCV permet la sélection et la croissance de petites variantes de colonie de Pseudomonas aeruginosa. La méthode est très définitive et permet une sélection plus facile que les méthodes normales. Ce protocole détaille également une méthode ELISA plus sûre et plus sensible pour la quantification de l’alginate par rapport à la méthode standard de carbazole acide uronique, permettant la quantification directe de l’alginate dans les échantillons sans cautérisation ni manipulation d’échantillon.
Brandon Kirby, technicien de laboratoire, et Roy Al Ahmar, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontreront la procédure. Pour détecter la variante de petite colonie ou SCV, première strie de la souche P.aeruginosa PAO1 delta PYRD sur des plaques PIA préchauffées. Faire pousser les souches à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.
Sur la plaque de croissance, identifier un seul isolat de colonie qui a le phénotype de SCV caractérisé par une taille de colonie de un à trois millimètres par opposition à la taille normale de la colonie de trois à cinq millimètres. Resserrons les colonies sélectionnées pour obtenir un isolat pur du CVS. Pour effectuer l’activation physiologique de la voie de récupération, utilisez une boucle stérile d’inoculation pour choisir la colonie de SCV à partir de la plaque PIA.
Strier la colonie sélectionnée sur une plaque PIA préchauffée complétée par un uracil millimolaire de 0,1 millimlaire. Faire pousser la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Pour commencer l’analyse de carbazole à l’acide uronique, identifiez une seule colonie à partir d’une culture pure de la souche désirée à tester et choisissez la colonie à l’aide d’un cure-dent stérile.
Placez le cure-dent dans un tube à essai de culture contenant cinq millilitres de PIB. Poussez dans un incubateur shaker à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, ajouter un aliquot du bouillon PIB cultivé sur une plaque PIA préchauffée.
À l’aide d’un épandeur stérile de cellules, étendre le bouillon sur la plaque et croître à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. À l’aide d’un contrôleur de pipette et d’une pipette stérile de 50 millilitres, ajouter 0,85 % de chlorure de sodium à la pelouse adulte et recueillir l’échantillon en raclant la plaque à l’aide d’un épandeur cellulaire. Aspirer l’échantillon à l’aide d’une pipette fraîche de 50 millilitres et transférer dans un tube de collecte de 50 millilitres.
Vortex l’échantillon à haute hauteur pour mélanger et placer les échantillons sur la glace. Pour mesurer l’OD600 des échantillons, videz d’abord le spectrophotomètre à l’aide d’un millilitre de chlorure de sodium à 0,85 %. Ajouter ensuite un millilitre de l’échantillon à une nouvelle cuvette jetable et lire l’OD. Répétez cette étape deux fois pour obtenir un triplicate de lecture pour chaque échantillon.
Maintenant, ajoutez trois millilitres de la solution de borate acide sulfurique dans les tubes de culture et laissez reposer sur la glace. Ajouter lentement 350 microlitres de l’échantillon prélevé au mélange acide dans les tubes à essai. Après avoir brièvement vortexing sur faible, ajouter 100 microlitres de 0,1%carbazole et solution d’éthanol au mélange d’échantillons acides.
Caper le tube et le vortex sur le réglage moyen pendant cinq secondes. Ensuite, placez-le dans un bain sec à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, vortex les tubes brièvement à haute hauteur et laisser refroidir pendant cinq minutes.
Utilisez le tube avec du chlorure de sodium à 0,85 % comme blanc jusqu’au spectrophotomètre. Ajouter ensuite un millilitre du mélange à une cuvette propre et lire l’OD des échantillons à 530 nanomètres sur un spectrophotomètre. Préparez une courbe standard en mesurant l’OD530 des dilutions périodiques des concentrations connues d’acide d-mannuronique.
Répétez deux fois et extrayez une équation linéaire de ces lectures. Calculer la concentration de l’alginate dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard et diviser la concentration d’alginate de l’équation linéaire par OD600 pour obtenir la quantité totale d’alginate par OD600. À l’aide d’une micropipette, ajouter 50 microlitres de l’échantillon prélevé à une plaque non traitée de 96 puits.
Ajouter ensuite 50 microlitres de tampon de revêtement ELISA aux puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À l’aide d’une bouteille de gicler, laver les puits de la plaque deux fois avec du PBS-T en remplissant les puits, puis en les drainant en renversant la plaque.
Ajouter 200 microlitres de tampon de blocage aux puits avec une micropipette et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez la plaque deux fois avec PBS-T comme avant. Ajouter ensuite 100 microlitres d’anticorps primaires dilués aux puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures.
Après l’incubation, laver les puits de la plaque trois fois avec du PBS-T comme avant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués aux puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Après avoir lavé la plaque à nouveau trois fois, utilisez une micropipette pour ajouter 100 microlitres de solution TMB ELISA.
Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité en plaçant la plaque dans un tiroir ou en l’enveloppant dans du papier d’aluminium. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution stop. Utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l’OD à 450 nanomètres.
Produire une courbe standard en mesurant l’OD450 des dilutions périodiques des concentrations connues d’acide d-mannuronique. Répétez les mesures deux fois et extrayez une équation linéaire. Calculer la concentration de l’alginate dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard et diviser la concentration d’alginate de l’équation linéaire par OD600 pour obtenir la quantité totale d’alginate par OD600.
On y voit des échantillons de PAO581 et de PAO581 avec des mutations dans les gènes régulant la pyrimidine de novo biosynthèse cultivée sur PIA et PIA complétées par 0,1 millimolaire d’uracil. Les données montrent que la présence d’uracil dans les médias entraîne la conversion de la souche mutante en mucoïde comme le montre la production restaurée d’alginate. Ici, les résultats sont montrés pour l’anti-alginate à base d’anticorps monocoque ELISA.
Les colonies sont cultivées sur des plaques PIA avec arabinose pour l’induction du promoteur PBAD et du plasmide pHERD-20T. Sont montrés PAO1, PAO1 portant l’expression plasmide pHERD-20T avec l’alginate principal facteur sigma spécifique algU, et PAO1 avec une suppression dans le cadre du gène algD dans le codage de l’enzyme biosynthétique clé GDP-mannose dehydrogenase. Ces données comparent les niveaux non mucoïdes d’alginate mesurés pour l’algD du delta PAO1 et PAO1 par rapport aux niveaux mucoïdes d’alginate mesurés pour pao1 avec pHERD-20T algU.
L’ELISA anti-alginate a également été testé sur des échantillons d’expectorations de patients sans croissance préalable sur les plaques. Trois échantillons d’expectoration de CF qui ont eu la croissance du mucoid P.aeruginosa ont montré l’alginate détectable comparé à deux échantillons d’expectoration patient qui ont contenu le P.aeruginosa non mucoïde ou aucune croissance de P.aeruginosa. La préparation des courbes standard pour la quantification de l’alginate est très cruciale car cela permettra une mesure précise et précise de l’alginate dans l’échantillon.
La solution acide utilisée dans la méthode carbazole sont très dangereuses, de sorte que l’équipement de protection individuelle approprié et les précautions doivent être utilisés pour assurer la sécurité. Après l’isolement des VS, d’autres profils génétiques peuvent être effectués pour mieux comprendre les mutations qui se produisent et la pathogénie associée à de telles mutations. La méthode ELISA peut être adaptée pour surveiller l’infection pulmonaire chronique chez les patients atteints de fibrose kystique.
En outre, notre méthode de croissance pourrait aider à diagnostiquer les infections causées par des VSS spécifiques.
