Небольшой вариант колонии или SCV техника позволяет для выбора и роста небольших вариантов колонии Pseudomonas aeruginosa. Метод является очень окончательным и позволяет легче выбора, чем обычные методы. В этом протоколе также подробно более безопасный, более чувствительный метод ELISA для количественной оценки альгината по сравнению со стандартным методом карбазола урановой кислоты, позволяющий прямой альгинат количественной оценки в образцах без прижигания или манипуляции образца.
Демонстрация процедуры будет Брэндон Кирби, лаборант, и Рой Аль Ахмар, аспирант из моей лаборатории. Чтобы обнаружить вариант небольшой колонии или SCV, первая полоса P.aeruginosa штамм PAO1 дельта PYRD на предварительно разогретых пластин PIA. Рост штаммов на 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов.
На пластине роста определите один изолят колонии, который имеет фенотип SCV, характеризующийся размером колонии от одного до трех миллиметров, в отличие от обычного размера колонии размером от трех до пяти миллиметров. Повторно полоса выбранных колоний, чтобы получить чистый изолят SCV. Для выполнения физиологической активации пути спасения используйте стерильную петлю прививки, чтобы выбрать колонию SCV из пластины PIA.
Полоса выбранной колонии на предварительно разогретой пластине PIA, дополненной 0,1 миллимолярным урацилом. Расти пластины на 37 градусов по Цельсию в течение 24 до 48 часов. Чтобы начать анализ карбазола мочевой кислоты, определите одну колонию из чистой культуры желаемого штамма, который будет протестирован, и выберите колонию с помощью стерильной зубочистки.
Поместите зубочистку в культурную пробирку, содержащую пять миллилитров PIB. Расти в шейкер инкубатор при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. После инкубации добавьте алицит культурного бульона PIB на предварительно разогретую пластину PIA.
Используя стерильный распределитель клеток, разложить бульон по тарелке и расти при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. Используя контроллер пипетки и стерильный 50-миллилитровый пипетку, добавьте 0,85% хлорида натрия к взрослому газону и соберите образец, соскоб пластины с помощью распределитель клеток. Аспирировать образец с помощью свежей 50 миллилитров пипетки и передать в 50 миллилитров трубки сбора.
Vortex образец на высоком смешать и поместить образцы на льду. Для измерения OD600 образцов, сначала пустой спектрофотометр с помощью одного миллилитра 0,85% хлорида натрия. Затем добавьте один миллилитр образца в новый одноразовый кювет и прочитайте OD. Повторите этот шаг дважды, чтобы получить тройной считывает для каждого образца.
Теперь добавьте три миллилитров раствора серной кислоты в культурные трубки и дайте посидеть на льду. Добавьте 350 микролитров собранного образца медленно в кислотную смесь в пробирках. После краткого вихря на низком уровне, добавить 100 микролитров 0,1%карбазола и этанола раствор смеси образца кислоты.
Крышка трубки и вихря на средней настройки в течение пяти секунд. Затем поместите в сухую ванну при 55 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После инкубации, вихрь трубы кратко на высоком и дайте остыть в течение пяти минут.
Используйте трубку с 0,85% хлорида натрия в качестве пустого для спектрофотометра. Затем добавьте один миллилитр смеси в чистый кювет и прочитайте OD образцов на 530 нанометров на спектрофотометре. Подготовьте стандартную кривую путем измерения OD530 серийных разбавлений известных концентраций d-маннуроновой кислоты.
Повторите дважды и извлечь линейное уравнение из этих показаний. Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце, используя стандартную кривую, и разделите концентрацию альгината от линейного уравнения на OD600, чтобы получить общее количество альгината на OD600. Используя микропипюту, добавьте 50 микролитров собранного образца в необработанную пластину из 96 колодец.
Затем добавьте 50 микролитров буфера покрытия ELISA к скважинам. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Использование шприц бутылку, мыть пластины скважин в два раза с PBS-T путем заполнения скважин, а затем слива их, перевернут пластины более.
Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера в скважины с помощью микропипетта и инкубировать при четырех градусах Цельсия за ночь. На следующий день, мыть тарелку дважды с PBS-T, как и раньше. Затем добавьте 100 микролитров разбавленного первичного антитела к скважинам и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного-двух часов.
После инкубации, мыть пластины скважин три раза с PBS-T, как и раньше. Затем добавьте 100 микролитров разбавленного вторичного антитела к скважинам и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного-двух часов. После мытья пластины снова три раза, используйте micropipette добавить 100 микролитров раствора TMB ELISA.
Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте, поместив пластину в ящик или упаковка в фольгу. Затем добавьте 100 микролитров стоп-раствора. Используйте считыватель пластин для измерения OD на 450 нанометров.
Создайте стандартную кривую, измерив OD450 серийных разбавлений известных концентраций d-маннуроновой кислоты. Повторите измерения дважды и извлекайте линейное уравнение. Рассчитайте концентрацию альгината в каждом образце, используя стандартную кривую, и разделите концентрацию альгината от линейного уравнения на OD600, чтобы получить общее количество альгината на OD600.
Здесь показаны образцы PAO581 и PAO581 с мутациями в генах, регулирующих пиримидин де ново биосинтез, выращенный на PIA и PIA, дополненный 0,1 миллимолялем урацила. Данные показывают, что наличие урацила в средствах массовой информации приводит к преобразованию штамма мутантов обратно в слизистую оболочку, как видно из восстановленного производства альгината. Здесь показаны результаты для антиалгинатных моноклональных антител на основе ELISA.
Колонии выращиваются на пластинах PIA с арабинозой для индукции ПБАД промоутера и плазмиды PHERD-20T. Показаны PAO1, PAO1 проведения выражения плазмидной pHERD-20T с основным альгинатом конкретных сигма фактор algU, и PAO1 с в кадре удаление гена algD в кодировании ключевых альгинат биосинтетических ферментов GDP-манноза дегидрогеназы. Эти данные сравнивают немукоидные уровни альгината, измеренные для PAO1 и PAO1 delta algD, по сравнению с уровнями слизистой оболочки альгината, измеренными для PAO1, с pHERD-20T algU.
Анти-альгинат ELISA также был протестирован на образцах мокроты пациента без предварительного роста на пластинах. Три образца мокроты CF, которые имели рост слизистой P.aeruginosa показали обнаруживаемый альгинат по сравнению с двумя образцами мокроты пациента, которые содержали либо немукоидный P.aeruginosa или нет роста P.aeruginosa. Подготовка стандартных кривых для количественной оценки альгината имеет очень важное значение, поскольку это позволит точно и точно измерить альгинат в образце.
Кислотный раствор, используемый в методе карбазола, очень опасен, поэтому для обеспечения безопасности необходимо использовать надлежащее средства индивидуальной защиты и меры предосторожности. После изоляции SCV, дальнейшее генетическое профилирование может быть сделано, чтобы лучше понять происходящие мутации и патогенность, связанную с такими мутациями. Метод ELISA может быть адаптирован для мониторинга хронической инфекции легких у пациентов с муковисцидозом.
Кроме того, наш метод роста может помочь диагностировать инфекции, вызванные конкретными SCV.
