Küçük koloni varyantı veya SCV tekniği Pseudomonas aeruginosa küçük koloni varyantları seçimi ve büyüme sağlar. Yöntem çok kesin ve normal yöntemlere göre daha kolay seçim sağlar. Bu protokol aynı zamanda aljinat kantifikasyonu için standart üronik asit karbazol yöntemine kıyasla daha güvenli ve daha hassas bir ELISA yöntemini ayrıntılarıyla anlatarak, numunelerde katutery veya numune manipülasyonu olmaksızın doğrudan aljinat nicelemesini sağlar.
Prosedürü gösteren brandon Kirby, bir laboratuvar teknisyeni ve Roy Al Ahmar, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Küçük koloni varyantını veya SCV'yi tespit etmek için, önceden ısıtılmış PIA plakaları üzerinde p.aeruginosa zorlanma PAO1 delta PYRD ilk çizgi. Suşları 48 saat boyunca 37 derecede büyütün.
Büyüme plakası üzerinde, normal üç ila beş milimetre lik koloni boyutuna karşılık bir ila üç milimetrelik bir koloni boyutu ile karakterize SCV fenotip olan tek bir koloni izole tanımlayın. SCV'nin saf bir yalıtımını elde etmek için seçilen kolonileri yeniden çizgileyin. Kurtarma yolunun fizyolojik aktivasyonunu gerçekleştirmek için, PIA plakasından SCV kolonisini seçmek için steril bir aşılama döngüsü kullanın.
Seçilen koloniyi 0,1 milimolar urasil ile takviye edilmiş önceden ısıtılmış PIA plakası üzerinde çizgi. 24 ila 48 saat boyunca 37 santigrat derece plaka büyütün. Üronik asit karbazol testine başlamak için, test edilecek istenilen suş saf bir kültürden tek bir koloni belirlemek ve steril bir kürdan kullanarak koloni almak.
Kürdanı beş mililitre PIB içeren bir kültür test tüpüne yerleştirin. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir shaker kuluçka büyütün. Kuluçkadan sonra, önceden ısıtılmış PIA plakasına kültürlü PIB suyu bir aliquot ekleyin.
Steril bir hücre yayıcı kullanarak, plaka üzerinde suyu yayıldı ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede büyümek. Bir pipet denetleyicisi ve steril 50 mililitrelik pipet kullanarak, yetişkin çim% 0.85 sodyum klorür ekleyin ve bir hücre dağıtıcı kullanarak plaka kazınarak örnek toplamak. Taze 50 mililitrelik pipet kullanarak numuneyi aspire edin ve 50 mililitrelik toplama tüpüne aktarın.
Karışımı ve buz üzerinde yer için yüksek üzerinde örnek Girdap. Örneklerin OD600 ölçmek için, ilk boş spektrofotometre kullanarak bir mililitre kullanarak 0.85% sodyum klorür. Sonra yeni bir tek kullanımlık cuvette için örnek bir mililitre ekleyin ve OD okuyun. Her örnek için bir okuma triplicate elde etmek için bu adımı iki kez tekrarlayın.
Şimdi kültür tüpleri içine sülfürik asit borat çözeltisi üç mililitre ekleyin ve buz üzerinde oturup sağlar. Test tüplerinde asit karışımı yavaş yavaş toplanan örnek 350 mikrolitre ekleyin. Kısa bir süre düşük girdap sonra, asit örnek karışımına% 0.1 karbazol ve etanol çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin.
Tüpü ve girdabı orta ayarda beş saniye boyunca kaplayın. Sonra 30 dakika boyunca 55 santigrat derece kuru bir banyo yerleştirin. Kuluçkadan sonra tüpleri kısa bir süre yüksekte talan edin ve beş dakika soğumaya bırakın.
Spektrofotometreye boş olarak %0,85 sodyum klorür içeren tüpü kullanın. Sonra temiz bir cuvette karışımın bir mililitre ekleyin ve bir spektrofotometre üzerinde 530 nanometre de örneklerin OD okuyun. Bilinen d-mannuronik asit konsantrasyonlarının Seri seyreltmelerinin OD530'u ölçerek standart bir eğri hazırlayın.
İki kez tekrarlayın ve bu okumalardan doğrusal bir denklem ayıklayın. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu doğrusal denklemden OD600 ile bölün. Mikropipet kullanarak, toplanan numunenin 50 mikrolitresini işlenmemiş 96 kuyuluk bir tabağa ekleyin.
Daha sonra kuyulara 50 mikrolitre ELISA kaplama tamponu ekleyin. Plakayı 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Bir fışkırtma şişesi kullanarak, kuyuları doldurarak ve sonra plakayı ters çevirerek süzerek plaka kuyularını PBS-T ile iki kez yıkayın.
Bir mikropipet ile kuyulara tampon engelleme 200 mikrolitre ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat inkübat. Ertesi gün, daha önce olduğu gibi PBS-T ile iki kez plaka yıkayın. Sonra kuyulara seyreltilmiş birincil antikor 100 mikrolitre ekleyin ve bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçka.
Kuluçkadan sonra, plaka kuyularını daha önce olduğu gibi PBS-T ile üç kez yıkayın. Daha sonra, kuyulara 100 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve 37 derecede 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı üç kez tekrar yıkadıktan sonra, 100 mikrolitre TMB ELISA çözeltisi eklemek için bir mikropipet kullanın.
Tabağı bir çekmeceye yerleştirerek veya folyoya sararak 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sonra stop çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. 450 nanometre de OD ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
Bilinen d-mannuronik asit konsantrasyonlarının Seri seyreltmelerinin OD450'sini ölçerek standart bir eğri üretin. Ölçümleri iki kez tekrarlayın ve doğrusal bir denklem ayıklayın. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için aljinat konsantrasyonunu OD600 ile doğrusal denklemden ayırın.
Burada gösterilen PAO581 ve PAO581 örnekleri pia ve PIA üzerinde yetiştirilen pimimidin de novo biyosentezdüzenleyen genlerde mutasyonlar ile 0.1 milimolar urasil ile takviye. Veriler, medyada urasil varlığının mutant geriliminin restore edilen aljinat üretiminde görüldüğü gibi mucoidy'e dönüştürülmesiyle sonuçlanmasına yol açtığını göstermektedir. Burada anti-aljinat monoklonal antikor bazlı ELISA için sonuçlar gösterilmiştir.
PBAD promotörü ve pHERD-20T plazmidinin indüksiyonu için arabinoselu PIA plakaları üzerinde koloniler yetiştirilir. Gösterilen PAO1, PAO1 ana aljinat spesifik sigma faktörü algU ile ifade plazmid pHERD-20T taşıyan, ve PAO1 anahtar aljinat biyosentetik enzim GSY-mannose dehidrogenaz kodlama algD geninin bir çerçeve silme ile. Bu veriler PAO1 ve PAO1 delta algD için ölçülen aljinat mukoid olmayan aljinat düzeylerini pHERD-20T algU ile PAO1 için ölçülen aljinat mukoid düzeyleri ile karşılaştırılır.
Anti-aljinat ELISA da plakalar üzerinde önceden büyüme olmadan hasta balgam örnekleri üzerinde test edildi. Mucoid P.aeruginosa büyümesi olan üç CF balgam örneği, mukoid olmayan P.aeruginosa veya P.aeruginosa büyümesi içermeyen iki hasta balgam örneği ile karşılaştırıldığında saptanabilir aljinat gösterdi. Aljinat ölçümü için standart eğrilerin hazırlanması çok önemlidir, çünkü bu örnek içinde aljinatın kesin ve doğru ölçümü ne olanak sağlayacaktır.
Karbazol yönteminde kullanılan asit çözeltisi çok tehlikelidir, bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman ve güvenlik sağlamak için önlemler kullanılmalıdır. SCV'leri izole ettikten sonra, meydana gelen mutasyonları ve bu mutasyonlarla ilişkili patojeniteyi daha iyi anlamak için daha fazla genetik profilleme yapılabilir. ELISA yöntemi kistik fibrozisli hastalarda kronik akciğer enfeksiyonunu izlemek için uyarlanabilir.
Ayrıca, büyüme yöntemimiz spesifik SCV'lerin neden olduğu enfeksiyonların teşhisine yardımcı olabilir.
