A pequena variante colônia ou técnica SCV permite a seleção e o crescimento de pequenas variantes de colônias de Pseudomonas aeruginosa. O método é muito definitivo e permite uma seleção mais fácil do que os métodos normais. Este protocolo também detalha um método ELISA mais seguro e sensível para quantificação de alginato em comparação com o método padrão de carbazole ácido urônico, permitindo quantificação direta de alginato em amostras sem cauteria ou manipulação de amostras.
Demonstrando o procedimento estarão Brandon Kirby, um técnico de laboratório, e Roy Al Ahmar, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para detectar a pequena variante colônia ou SCV, primeiro traço a cepa P.aeruginosa PAO1 delta PYRD em placas PIA pré-aquecidas. Asse as cepas a 37 graus Celsius por 48 horas.
Na placa de crescimento, identifique um único isolado de colônia que tenha o fenótipo SCV caracterizado por uma colônia de um a três milímetros em oposição ao tamanho normal da colônia de três a cinco milímetros. Re-listrar as colônias selecionadas para obter um isolado puro do SCV. Para realizar a ativação fisiológica da via de salvamento, utilize um laço de inoculação estéril para escolher a colônia SCV da placa PIA.
Listrar a colônia selecionada em uma placa PIA pré-aquecida complementada com uracil de 0,1 milimililar. Cresça a placa a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas. Para iniciar o ensaio de carbazole ácido urônico, identifique uma única colônia a partir de uma cultura pura da cepa desejada a ser testada e escolha a colônia usando um palito estéril.
Coloque o palito em um tubo de ensaio cultural contendo cinco mililitros de PIB. Cresça em uma incubadora de shaker a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, adicione uma alíquota do caldo PIB cultivado em uma placa PIA pré-aquecida.
Usando um espalhador de células estéreis, espalhe o caldo sobre a placa e cresça a 37 graus Celsius por 24 horas. Usando um controlador de pipeta e uma pipeta estéril de 50 mililitros, adicione cloreto de sódio de 0,85% ao gramado adulto e colete a amostra raspando a placa usando um espalhador de células. Aspire a amostra usando uma pipeta fresca de 50 mililitros e transfira para um tubo de coleta de 50 mililitros.
Vórtice a amostra em alta para misturar e colocar as amostras no gelo. Para medir o OD600 das amostras, primeiro em branco o espectrofotômetro usando um mililitro de cloreto de sódio de 0,85%. Em seguida, adicione um mililitro da amostra a um novo cuvette descartável e leia o OD. Repita esta etapa duas vezes para obter um triplicado de leituras para cada amostra.
Agora adicione três mililitros da solução de borato de ácido sulfúrico em tubos de cultura e deixe sentar-se no gelo. Adicione 350 microliters da amostra coletada lentamente à mistura de ácido nos tubos de ensaio. Depois de brevemente vórtice em baixo, adicione 100 microliters de 0,1% de solução de carbazole e etanol à mistura de amostra de ácido.
Tampe o tubo e o vórtice na configuração média por cinco segundos. Em seguida, coloque em um banho seco a 55 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, o vórtice os tubos em alta e deixe esfriar por cinco minutos.
Use o tubo com cloreto de sódio de 0,85% como um branco ao espectrômetro. Em seguida, adicione um mililitro da mistura a uma cuvette limpa e leia o OD das amostras a 530 nanômetros em um espectrômetro. Prepare uma curva padrão medindo o OD530 de diluições seriais de concentrações conhecidas de ácido d-mannurônico.
Repita duas vezes e extraia uma equação linear dessas leituras. Calcule a concentração do alginato em cada amostra usando a curva padrão e divida a concentração de alginato da equação linear por OD600 para obter a quantidade total de alginato por OD600. Usando uma micropipette, adicione 50 microliters da amostra coletada a uma placa de 96 poços não tratada.
Em seguida, adicione 50 microliters de tampão de revestimento ELISA aos poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por duas horas. Usando uma garrafa de esguicho, lave os poços da placa duas vezes com PBS-T preenchendo os poços e, em seguida, drenando-os, virando a placa.
Adicione 200 microliters de tampão de bloqueio aos poços com uma micropipette e incubar a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave a placa duas vezes com PBS-T como antes. Em seguida, adicione 100 microliters de anticorpo primário diluído aos poços e incubar a 37 graus Celsius por uma a duas horas.
Após a incubação, lave os poços da placa três vezes com PBS-T como antes. Em seguida, adicione 100 microliters de anticorpo secundário diluído aos poços e incubar a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Depois de lavar a placa novamente três vezes, use uma micropipette para adicionar 100 microliters da solução TMB ELISA.
Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro, colocando a placa em uma gaveta ou enrolando em papel alumínio. Em seguida, adicione 100 microliters de solução stop. Use um leitor de placas para medir o OD em 450 nanômetros.
Produzir uma curva padrão medindo o OD450 de diluições seriais de concentrações conhecidas de ácido d-mannurônico. Repita as medidas duas vezes e extraia uma equação linear. Calcule a concentração do alginato em cada amostra usando a curva padrão e divida a concentração de alginato da equação linear por OD600 para obter a quantidade total de alginato por OD600.
Aqui são mostradas amostras de PAO581 e PAO581 com mutações em genes que regulam a pirimidina de nova biossíntese cultivada em PIA e PIA complementadas com 0,1 milimolar de uracil. Os dados mostram que a presença de uracil na mídia resulta na conversão da cepa mutante de volta à mucoida, como visto pela produção restaurada de alginato. Aqui, os resultados são mostrados para o ELISA baseado em anticorpos monoclonais anti-alginato.
Colônias são cultivadas em placas PIA com arabinose para a indução do promotor do PBAD e do plasmídeo pHERD-20T. São mostrados PAO1, PAO1 carregando a expressão plasmid pHERD-20T com o principal alginato específico sigma factor algU, e PAO1 com uma exclusão no quadro do gene algD na codificação da enzima biossintética chave GDP-mannose desidaserogen. Esses dados comparam os níveis não mucoides de alginato medidos para PAO1 e PAO1 delta algD versus os níveis mucoides de alginato medidos para PAO1 com algU pHERD-20T.
A ELISA anti-alginato também foi testada em amostras de escarro do paciente sem crescimento prévio nas placas. Três amostras de escarro cf que tiveram crescimento de p.aeruginosa mucoide mostraram alginato detectável em comparação com duas amostras de escarro de pacientes que continham p.aeruginosa não mucoide ou nenhum crescimento de P.aeruginosa. A preparação das curvas padrão para a quantificação de alginato é muito crucial, pois isso permitirá uma medição precisa e precisa do alginato dentro da amostra.
A solução ácida usada no método carbazole é muito perigosa, por isso devem ser utilizadas precauções e equipamentos de proteção individual adequados para garantir a segurança. Após isolar os SCVs, mais perfis genéticos podem ser feitos para entender melhor as mutações que ocorrem e a patogenicidade associada a tais mutações. O método ELISA pode ser adaptado para monitorar a infecção pulmonar crônica em pacientes com fibrose cística.
Além disso, nosso método de crescimento poderia ajudar a diagnosticar infecções causadas por SCVs específicos.
